Schnell, empfindlich und niedrig | Nanning Peacock Pride Co., Ltd

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 7741 (2022) Diesen Artikel zitieren

3182 Zugriffe

3 Zitate

2 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Eine unzureichende Trinkwasserqualität gehört zu den Hauptursachen für vermeidbare Sterblichkeit, vor allem bei kleinen Kindern. Die Identifizierung kontaminierter Wasserquellen bleibt eine große Herausforderung, insbesondere dort, wo die Ressourcen begrenzt sind. Die aktuellen Methoden zur Messung von Escherichia coli (E. coli), dem von der WHO bevorzugten Indikator zur Messung der fäkalen Wasserverschmutzung, erfordern eine Inkubation über Nacht und erfordern eine spezielle Schulung. Im Jahr 2016 veröffentlichte UNICEF ein Target Product Profile (TPP), um Anreize für Produktinnovationen zu schaffen, mit denen geringe Mengen lebensfähiger E. coli in Wasserproben vor Ort in weniger als 6 Stunden nachgewiesen werden können. Angetrieben von dieser Herausforderung haben wir einen phagenbasierten Assay zum Nachweis und zur Halbquantifizierung von E. coli entwickelt. Wir haben einen Phagencocktail formuliert, der insgesamt 8 Phagen enthält, die anhand einer umfangreichen Bakterienstammbibliothek ausgewählt und mit dem empfindlichen NanoLuc-Luciferase-Reporter rekombiniert wurden. Der Assay wurde für die Verarbeitung in einem eigens entwickelten Mikrofluidik-Chip optimiert und anhand lokaler Abwasserproben und an Trinkwasserquellen in Nairobi, Kenia, getestet. Mit diesem Assay in Kombination mit der Mikrofluidik-Chip-Plattform bieten wir eine vollständig automatisierte Lösung zum Nachweis und zur Halbquantifizierung von E. coli bei weniger als 10 MPN/100 ml in 5,5 Stunden durch minimal geschultes Personal.

Die Bedeutung eines nachhaltigen Zugangs zu sauberem Trinkwasser ist weiterhin von entscheidender Bedeutung für die Verringerung der Armut und die Verbesserung der Gesundheit und des Wohlbefindens der Weltbevölkerung. Obwohl Fortschritte bei der Verwirklichung der Ziele für nachhaltige Entwicklung und deren Schwerpunkt auf der Verbesserung des Zugangs zu sauberem Wasser (SDG 6)1 erzielt wurden, bleibt die Qualität vieler Wasservorräte ungewiss. Durchfallerkrankungen, die hauptsächlich auf verunreinigte Lebensmittel und Wasser zurückzuführen sind, sind nach wie vor die weltweit zweithäufigste Todesursache bei Kindern unter fünf Jahren und verursachen 8 % aller Todesfälle weltweit, wobei 80 % der Todesfälle in Südasien und südlich der Sahara auftreten Afrika2. Die Überprüfung der Wasserqualität auf das Vorhandensein von Durchfallerregern ist für das Wohlergehen von Millionen Menschen von entscheidender Bedeutung.

Eines der größten mikrobiellen Risiken ist mit der Aufnahme von Wasser verbunden, das mit Fäkalien von Menschen oder Tieren kontaminiert ist3. Obwohl die meisten Kolibakterien für den Menschen harmlos sind, werden sie in Tests eingesetzt, um das potenzielle Vorhandensein gefährlicher Krankheitserreger anzuzeigen. Insbesondere E. coli weist viele ideale Eigenschaften eines Indikatororganismus auf, da er fast ausschließlich aus menschlichen und tierischen Fäkalien stammt und einige pathogene Stämme umfasst (z. B. O157:H7)4. Während die Verwendung von Fäkalienindikatoren (Kolibakterien, thermotolerante Kolibakterien, E. coli) kritisiert wird, da ihr Vorhandensein nur darauf hindeutet, dass das Risiko des Vorhandenseins von Krankheitserregern gestiegen ist, bleibt die Überwachung auf Hunderte bekannter Krankheitserreger im Wasser unpraktisch und eine schnelle Durchführung äußerst schwierig und zu geringen Kosten4. Darüber hinaus sind Informationen über die Menge des Fäkalienindikators wichtig, da das Risiko einer durch Wasser übertragenen Infektion mit dem Grad der Kontamination steigt.

Akzeptable Grenzwerte für Bakterien wurden unter anderem von der WHO definiert3 und besagt, dass sämtliches zum Trinken bestimmtes Wasser in keiner 100-ml-Probe nachweisbare E. coli oder thermotolerante coliforme Bakterien enthalten darf, wobei E. coli jetzt der bevorzugte Indikator ist. Die am häufigsten verwendeten Methoden zum Nachweis von Kolibakterien in Wasserproben sind Membranfiltration, Mehrfachröhrchenfermentation unter Verwendung der Methode der wahrscheinlichsten Zahl (MPN) und An-/Abwesenheitstests wie der Schwefelwasserstofftest5. Während diese Methoden eine Empfindlichkeit von 1 KBE/100 ml zwischen 0,5 und 7,5 US-Dollar pro Test erreichen können, sind sie oft arbeitsintensiv, erfordern eine spezielle Schulung des Personals, sind vor Ort schwierig anzuwenden und erfordern lange Inkubationszeiten, typischerweise über Nacht6. Kein Test kann niedrige Konzentrationen lebensfähiger E. coli im Wasser in weniger als 8 Stunden7 schnell erkennen.

Das Produktinnovationsteam von UNICEF startete das Projekt zur schnellen E. coli-Erkennung, um die Entwicklung neuer Produkte zu fördern, um Gemeinden und Regierungspartnern wichtige Informationen über die Wasserqualität zu liefern, damit sie unreines Wasser behandeln und Bereiche mit Verbesserungspotenzial bei der Wasserverschmutzung identifizieren können. Dementsprechend hat UNICEF ein Target Product Profile (TPP) herausgegeben, um die Industrie bei der Entwicklung von Produkten anzuleiten, die die fäkale Kontamination so schnell wie möglich genau bestimmen8.

Eine neue Generation von Assays verwendet manipulierte Bakteriophagen zum Nachweis von Krankheitserregern9, 10. Phagen sind Viren, die Bakterien infizieren und sich darin vermehren und zu den häufigsten und vielfältigsten Einheiten in der Biosphäre gehören. Sie weisen aufgrund komplexer Wechselwirkungen zwischen den Phagenbindungsproteinen und der Bakterienzelloberfläche spezifische Wirtsbereiche auf11. Phagen können genetisch verändert werden, um die genetische Information eines Reporterproteins zu tragen, das während der Phagenreplikation im Inneren der Bakterien exprimiert wird. Die Verwendung von Reporterphagen als Nachweismethoden wurde bereits früher zum Nachweis von Krankheitserregern, einschließlich Listeria12, Mycobacterium13, Salmonella14 und E. coli15, nachgewiesen. Zu den häufig verwendeten Reportern gehören unter anderem alkalische Phosphatase16, grün fluoreszierendes Protein (GFP)13, bakterielle Luciferase (Lux-Systeme)12, 17 und NanoLuc®-Luciferase18,19,20. NanoLuc-Luciferase erzeugt ein 100-mal stärkeres Lumineszenzsignal als andere Luciferasen und ist ein kleineres Protein (19 kDa), das auf dem Substrat Furimazin basiert, um eine stabile, leuchtende Lumineszenz zu erzeugen21.

Hier verwenden wir einen Cocktail aus NanoLuc-Luciferase-Reporterphagen, um E. coli-Kontaminationen im Wasser gezielt nachzuweisen. Wir haben einen sehr empfindlichen und schnellen Assay entwickelt, der den Nachweis von weniger als 10 MPN E. coli in 100 ml Wasser in 5,5 Stunden ermöglicht, der die UNICEF TPP-Anforderungen erfüllt und somit Tests am selben Tag ermöglicht. Der Phagencocktail verfügt über ein breites E. coli-Wirtsspektrum, das die Verwendung des Assays für jede Wasserquelle ermöglicht. Schließlich wird der Assay in einem Mikrofluidik-Chip durchgeführt, der für die Integration in einen automatisierten Instrumentenprototyp (eine Filtereinheit, eine Liquid-Handling-Einheit und eine Detektionseinheit)22 für den Einsatz im Feld konzipiert ist. Die Gesamtkosten des mikrofluidischen Einweggeräts betragen weniger als 1 US-Dollar, und die zugehörige Instrumentierung erfüllt die vom UNICEF TPP8 festgelegten Kostenziele, was diese Plattform zu einer geeigneten Alternative zu aktuellen E. coli-Feldtestkits macht.

Im Bakteriophagen T4 ist Hoc (Highly Antigenic Outer Capsid Protein) ein stark exprimiertes, nicht essentielles Kapsiddekorationsprotein23, dessen Genlocus erfolgreich verwendet wurde, um Proteine in das Genom des Phagen einzufügen24. Ähnliche Proteine wurden in zahlreichen Bakteriophagen und doppelsträngigen Viren identifiziert25,26,27,28. Die Genomsequenzanalyse unserer Phagenbibliothek zeigte das Vorhandensein von Hoc-Homologen in mehreren Genomen, darunter BW-1, HER252, Phi3, RB69, T7, TH07 und TH09, und wurde als Insertionsstelle für einen an eine Cellulose fusionierten NanoLuc-Reporter verwendet -Bindungsmotiv-Expressionskassette (CBM). Wie in Abb. 1a dargestellt, verwendeten wir das CRISPR/Cas9-System29,30,31 zur Konstruktion aller Phagen mit Ausnahme von T7 und TH09, bei denen die einfachere homologe Rekombination allein ausreichte, um rekombinante DNA in das Phagengenom einzuführen.

(a) Schematische Darstellung der In-vivo-Phagenrekombination mit dem CRISPR-Cas9-System. Wirtsbakterienzellen werden mit einem Donorplasmid transformiert, das den Reporter NanoLuc-CBM, flankiert von linken und rechten Homologieregionen zum Phagen (LHR und RHR), sowie ausgewählte crRNA- und Spacersequenzen enthält. (b) Der Phagen-Plaque-Assay zeigt das Vorhandensein von Plaques im Bakterienrasen (oberes Foto) und die NanoLuc-Aktivität in den Plaques bei der Aufnahme in einem dunklen Raum (unteres Foto). Erstellt mit BioRender.com.

Das pCas9-Plasmid exprimiert S. pyogenes Cas9 und tracrRNA von seinem nativen Promotor, und eine synthetische Sequenz stromabwärts des Lac-Promotors exprimiert konstitutiv die crRNA-Leadersequenz und drei Spacer, die von direkten Wiederholungen flankiert werden. Die Verwendung mehrerer Spacer, die auf den Hoc-Locus eines bestimmten Phagen gerichtet sind, erfolgt in zweierlei Hinsicht; (1) Mehrere gRNA, die auf einen Locus gerichtet sind, maximieren die Häufigkeit der Cas9-vermittelten Spaltung des Zielphagen. (2) Die Sequenzkonservierung innerhalb des Hoc-Locus ermöglicht die Verwendung einer synthetischen Sequenz zur Konstruktion mehrerer Phagen (mit einem oder zwei konservierten Spacern).

Die Leistung von gRNAs wurde durch Messung der Plaque-Effizienz (EOP) bestimmt, definiert als die logarithmische Reduktion des Phagentiters auf dem Stamm, der sowohl Cas9 als auch gRNA exprimiert, im Vergleich zu dem Stamm, der nur Cas9 exprimiert. Eine Plaque-Effizienz von 3 oder höher zeigte an, dass das CRISPR/Cas9-System wie gewünscht funktioniert, und die gRNAs wurden ausgewählt, um rekombinante Phagen zu erzeugen (Tabelle S2). Die erfolgreiche homologe Rekombination wurde durch NanoLuc-Aktivität in den durch die rekombinanten Phagen gebildeten Plaques und Sequenzierung bestätigt (Abb. 1b). Überraschenderweise zeigte einer der NanoLuc-exprimierenden Phagen, der während der Konstruktion des rekombinanten TH09-Phagen isoliert wurde, eine begrenzte Homologie zur Sequenz des übergeordneten TH09-Phagen. Wir nehmen an, dass sein ursprünglicher Elternphage in einer sehr geringen Konzentration vorlag, eine Rekombination in der zum TH09-Donorplasmid homologen Region durchlief und auf der Grundlage der NanoLuc-Aktivität ausgewählt wurde. Der Sequenzvergleich ergab, dass es sich um einen T4-ähnlichen Phagen handelt. Dieser Phage wurde PJ133 genannt.

Aufgrund der Art des Promotors, der die Expression des Reporters steuert, wird NanoLuc während der Amplifikation der Phagen zur Produktion von Reagenzien mit hohem Titer konstitutiv exprimiert und trägt zum Hintergrundsignal in nachfolgenden Tests bei. Um die Empfindlichkeit unserer nachgelagerten Tests zu verbessern, haben wir daher Methoden zur Reinigung des Reporters entwickelt.

Der Phagen T7 wurde gereinigt, indem das an NanoLuc fusionierte Cellulose-Bindungsmodul (CBM) genutzt und aufeinanderfolgende Wäschen mit Perlen auf Cellulosebasis durchgeführt wurden, um den Reporter zu binden und zu entfernen. Diese Methode, die ursprünglich für alle rekombinanten Phagen gedacht war, war für andere Phagen nicht wirksam. Wir stellten die Hypothese auf, dass einige der Phagen an die Kügelchen binden, was zu einem niedrigen Endtiter der gereinigten Phagenlösung führt, und dass in einigen Fällen der Reporter die Kügelchen mit geringer Effizienz bindet, was zu einem hohen Hintergrundsignal führt, wie es für den Phagen Phi6 beobachtet wurde . Die Tangentialflussfiltration (TFF) unter Verwendung von Kartuschen mit 500-kDa-Cutoff-Membranen erwies sich als zuverlässige Methode zur Entfernung des Reporters aus diesen Phagenlösungen. Die Filtration wurde 12–18 Stunden lang durchgeführt, bis die Lumineszenzwerte ein Plateau bei oder unter 1000 RLU erreichten. Die Filtrationseffizienz wurde durch die Zugabe von Detergens (0,05 % Tween 80) zum Medium während des Bakterienzellwachstums und der Phagenvermehrung kontinuierlich verbessert32. Konzentrationen von bis zu 0,3 % Tween 80 hatten keinen Einfluss auf das Bakterienwachstum und die Phageninfektion (Abb. S1).

Zur Bestimmung der endgültigen Zusammensetzung des Phagencocktails wurde ein Phagen-Down-Selektionsprozess verwendet, der mehrere Schritte umfasst, wie im Schema in Abb. 2a beschrieben.

(a) Beschreibung des Phagenselektionsprozesses: 1. Der Plaque-Assay wird mit der gesamten Phagenbibliothek (92 Stämme) gegen eine Teilmenge der E. coli-Bibliothek (79 Stämme) durchgeführt. Die ergänzende Datei 2 enthält die detaillierten Plaque-Plaque-Daten, 2. Phagen werden basierend auf dem berechneten additiven Wirtsbereich heruntergewählt (20 Stämme), 3. Phagen werden basierend auf der Rekombinationseffizienz mit dem NanoLuc-Reporter weiter heruntergewählt (10 Stämme), 4. Leistung des Lumineszenzassays gegen die gesamte E. coli-Bibliothek (339 Stämme), Reinigungserfolg und allgemeine Stabilität, um die endgültige Zusammensetzung des Phagencocktails (8 Stämme) zu bestimmen. (b) % der Bakterien, die bei einer Phageninfektion Plaques produzieren. (c) % der E. coli-Stämme, die gegenüber rekombinanten Phagen anfällig sind, bestimmt durch Lumineszenzassay. Im Vergleich zu den Plaque-Assay-Ergebnissen bei übereinstimmenden Stämmen ist der Wirtsbereich beim Lumineszenztest im Allgemeinen breiter (Einschub zeigt Beispiele; Abb. S2 enthält die vollständige Liste der Phagen und Ergänzungsdatei 2 zeigt einen direkten Vergleich bei übereinstimmenden Stämmen).

Im ersten Schritt wurden die Wirtsbereiche von 92 Phagen aus unserer Bibliothek durch Plaque-Assay an einer Untergruppe von E. coli-Stämmen getestet, die aus der ersten Hälfte der ECOR-Bibliothek (Stämme Nr. 1 bis Nr. 36)33 und 43 Umweltstämmen bestand. In diesem Experiment zeigte die im Rasen des Wirtsstamms beobachtete Bildung von Plaques die Phagenreplikation und -vermehrung innerhalb des Wirts und damit die Anfälligkeit des getesteten Bakterienstamms. Die Phagen zeigen eine große Variabilität in der Wirtsempfindlichkeit, wobei einige umfangreiche Wirtsbereiche aufweisen. Beispielsweise zeigten über 25 % der Wirtsstämme eine Anfälligkeit sowohl für TH09- als auch für HER259-Phagen, während 14 Phagen auf keinem der 79 getesteten Bakterienstämme Plaque bildeten (Abb. 2b und Tabellen S4 und S5 sowie Ergänzungsdatei 2). Basierend auf der Breite der einzelnen Phagen-Wirtsabdeckungen und der berechneten additiven Abdeckung der in Kombination verwendeten Phagen wurden 20 Phagen für die genetische Veränderung ausgewählt.

Der NanoLuc-Enzymreporter wurde erfolgreich in die Genomen von zwölf Phagen eingeführt und ihre Wirtsbereiche wurden mithilfe des Lumineszenztests an der gesamten internen Bibliothek des E. coli-Stammes (339 in den Methoden beschriebene und in den Tabellen S2 und S3 aufgeführte Stämme) bewertet. Für den Lumineszenztest, der sich besser für das Hochdurchsatz-Screening eignet, wurde ein Signal aus Vertiefungen, die sowohl einen E. coli-Wirt als auch einen rekombinanten Phagen enthielten, mit Kontrollvertiefungen verglichen, die nur den rekombinanten Phagen enthielten (Abb. 2c). Eine positive Wirtsanfälligkeit wurde in allen Vertiefungen aufgezeichnet, deren Lumineszenz über den mittleren Hintergrundwerten +3 Standardabweichungen (SD) lag. Beim Vergleich der Ergebnisse der Plaque- und Lumineszenztests an passenden Stämmen stellten wir fest, dass der auf dem Lumineszenztest basierende Wirtsbereich im Allgemeinen breiter ist und eine zusätzliche Sensibilität für den Wirtsbereich aufweist (Ergänzungsdatei 2). Diese Beobachtung ist beispielsweise für die Phagen HER252, BW-1 und PJ133 offensichtlich, bei denen der Wirtsbereich um 49 %, 57 % bzw. 75 % zunahm (Abb. 2c, Einschub und Abb. S2 zeigt den Rest). Phagen). Ein durch Plaque-Assay gemessener Vergleich des Wirtsbereichs zwischen manipulierten und Wildtyp-Phagen wurde für den Phagen T2 getestet und zeigte keine Unterschiede im Wirtsbereich, was darauf hindeutet, dass die Änderung im Wirtsbereich nicht auf eine Manipulation des Genoms des Phagen zurückzuführen ist. Darüber hinaus ist der Wirtsbereich des manipulierten Phagen PJ133 bei der Beurteilung durch Lumineszenz breiter als durch den Plaque-Assay (Ergänzungsdatei 2).

Die Liste der ausgewählten Phagen wurde auf der Grundlage verschiedener Faktoren wie Lysezeit, Effizienz der Reporterproduktion und Stabilität der gereinigten Phagenlösung weiter verfeinert, mit dem Ziel, Phagen mit hohen Titern (> 109 PFU/ml) und niedrigem Lumineszenzhintergrund zu kombinieren induzieren relativ schnell (< 3 h) die Expression eines starken Lumineszenzsignals und sind bei 4 °C stabil. Beispielsweise haben die Reporterphagen Phi7 und T7 ähnliche lumineszenzbasierte Wirtsbereiche; T7 lieferte jedoch zwei Stunden schneller ein positives Lumineszenzsignal und wurde gegenüber dem Phagen Phi7 selektiert. Der Titer des Phagen T2 sank im Laufe einiger Wochen während der Lagerung bei 4 °C um einige Logarithmen und wurde nicht als Kandidat für den Cocktail in Betracht gezogen. In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass der Titer des Phagen T6 während der Zentrifugationsschritte abnahm, und wurde zugunsten anderer Phagen mit besserer Stabilität während der Reinigung ebenfalls nachrangig behandelt. Schließlich wurde der Phagen Phi6 aufgrund der schlechten Reinigungseffizienz, die zu hohen Lumineszenzhintergrundwerten führte, zu Beginn des Prozesses entfernt.

Am Ende des Phagen-Engineering- und -Selektionsprozesses wurde ein Phagencocktail entwickelt, der acht Phagen enthielt: BW-1, HER252, Phi3, PJ133, RB69, T7, TH07 und TH09. Das Ergebnis des Wirtsbereichstests basierend auf dem Lumineszenztest unserer gesamten E. coli-Stammbibliothek für die ausgewählten Phagen ist in Abb. 2c dargestellt. Die Abdeckung des Wirtsbereichs variiert zwischen 27 % (T7) und 70 % (BW-1) und macht bis zu 90 % der Bibliothek aus, wenn wir davon ausgehen, dass keine negativen Interferenzen durch die verschiedenen Phagen auftreten.

Der Laborstamm ATCC 25922 wurde ausgewählt, um die Dauer der Phageninfektion zu bestimmen und die niedrigste bakterielle Nachweisgrenze zu erreichen. Dabei wurde ein Cocktail aus acht Phagen verwendet, da es sich um einen von der US-Umweltschutzbehörde EPA gelisteten QC-Stamm für die Trinkwasseranalyse handelt. Der Stamm ist empfindlich gegenüber den Phagen HER252, BW1 und PJ133, wobei der Phagen BW1 das stärkere Lumineszenzsignal induziert (Abb. S3). Wenn sich die Phagen im Cocktail befinden, haben wir beobachtet, dass das Signal von dem Phagen dominiert wird, der das stärkste Signal induziert. Eine serielle Verdünnung von Bakterienzellen in der stationären Phase wurde zunächst in einer 96-Well-Platte in Wachstumsmedium für 2 Stunden bei 37 °C inkubiert, um eine Erholung zu ermöglichen und die Zellen vor der Zugabe des Phagencocktails auf die Proteinexpression vorzubereiten.

Für den Schritt der Phageninfektion wurden die Bakterien 1, 1,5, 2 oder 2,5 Stunden lang mit den Phagen inkubiert, bevor der exprimierte NanoLuc-Reporter konzentriert und das resultierende Lumineszenzsignal gemessen wurde. Das Signal wird auf die Hintergrundlumineszenz normiert, die nur durch den Phagencocktail erzeugt wird, und für die verschiedenen Infektionszeiten bei mehreren Zellkonzentrationen verglichen, um die entsprechende Nachweisgrenze für jeden Zustand zu bestimmen (Abb. 3). Der MPN-Wert (Most Probable Number) stellt die Anzahl der Zellen dar, die pro Vertiefung hinzugefügt wurden, wie durch ein Quanti-Tray/2000-System in dreifacher Ausfertigung bestimmt. Mit zunehmender Kontaktzeit zwischen Phagen und Bakterienzellen nimmt die Grenze der Signalerkennung über dem Hintergrund ab. Beispielsweise führt eine Inkubationszeit von 1, 1,5 und 2 Stunden zu einem Signal, das doppelt so hoch ist wie der Hintergrund von 60, 20 bzw. 8 Zellen. Eine zusätzliche Inkubationszeit nach einer Gesamtinkubation von 4 Stunden führt nicht zu einem Anstieg des Signals über den getesteten Zellzahlbereich.

Medianes Lumineszenzsignal von 8 Replikaten mit auf Phagen-Nur-Hintergrund normalisiertem Interquartilbereich als Funktion von MPN/Well für 1-, 1,5-, 2- und 2,5-stündige Phagen-Inkubationen unter Verwendung von ATCC 25922 und dem 8-Phagen-Cocktail. MPN-Werte wurden mit Quanti-Tray/2000 in dreifacher Ausfertigung bestimmt. Die gestrichelte Linie stellt Werte bei 2× Hintergrund dar.

Beachten Sie, dass es beim Stamm ATCC 25922 weder einen Vorteil noch einen Nachteil zu geben scheint, wenn die Bakterien länger als 2 Stunden mit den Phagen inkubiert werden, da wir nach 2 Stunden ein Signalplateau beobachten. Daher werden wir für nachfolgende Experimente mit Feldproben, die nicht charakterisierte Bakterienpopulationen enthalten, und innerhalb des Mikrofluidikgeräts22 eine Phageninkubationszeit von 3 Stunden verwenden, um sicherzustellen, dass alle Bakterien Zeit haben, den enzymatischen Reporter zu produzieren.

Wir haben eine E. coli-Bibliothek mit einer großen geografischen (Tabellen S2 und S3) und genetischen Vielfalt zusammengestellt, um die Phagen für den Cocktail auszuwählen33. Dennoch wollten wir zu Beginn der Cocktailbildung beurteilen, ob dieser Phagenselektionsprozess auf für unsere Sammlung spezifische Bakterienpopulationen ausgerichtet war. Somit befand sich unser Cocktail zum Zeitpunkt dieser Feldauswertung in einem frühen Entwicklungsstadium und enthielt vier Phagen, nämlich Phi3, Phi7, RB69 und T7. Die Leistung des vorläufigen Phagencocktails wurde in Kombination mit einem frühen Mikrofluidik-Chip-Prototyp getestet, der die manuellen Schritte des Assays ersetzen sollte, wie in unserer vorherigen Arbeit22 beschrieben (Abb. 4a). Der Chip integriert eine erste Membran, in der Bakterien eingefangen, mit Phagen infiziert und der Reporter exprimiert wird. In einer zweiten Membran im Gerät wird der exprimierte Reporter konzentriert und nachgewiesen. Die Leistung des phagenbasierten Mikrofluidik-Assays wurde an lokalen Feldproben getestet, die aus dem Ngong-Fluss entnommen wurden, der durch die Stadt Nairobi in Kenia fließt. Die Proben waren im Allgemeinen sehr trüb und stark kontaminiert. Vor der Verarbeitung wurden Verdünnungen der Proben in sterilem destilliertem Wasser hergestellt, um verschiedene Bakterienkonzentrationen zu bestimmen (Abb. 4b).

Validierung eines vorläufigen Phagencocktail-Assays an lokalen Abwasserproben. (a) Erster Prototyp des Mikrofluidikgeräts zum Nachweis von E. coli in Wasserproben. Maßstabsbalken: 10 mm (b) Lumineszenzsignal normalisiert auf den reinen Phagen-Hintergrund von Wasserproben, die mit einem Cocktail aus 4 Phagen (Phi3, Phi7, RB69 und T7) gewonnen und durch das Mikrofluidik-Chip-Gerät verarbeitet wurden. Wasserproben wurden aus dem Ngong-Fluss entnommen, der durch die Stadt Nairobi fließt. Die CFU-Werte wurden mit einem Membranfiltrations-Feldkit bestimmt. Die gestrichelte Linie stellt Werte bei 2× Hintergrund dar.

Die Flüssigkeitszugabe zum Mikrofluidik-Chip erfolgte manuell mithilfe von Einwegvorrichtungen aus Silikonkautschuk, die die Einlass-/Auslassanschlüsse umgaben und eine Schnittstelle für Pipettenspitzen mit benötigten Reagenzien und Schläuchen bildeten, die an die Vakuumquelle angeschlossen waren. Eine an Auslassöffnungen angeschlossene Vakuumquelle wurde verwendet, um den Fluidfluss innerhalb des Mikrofluidikgeräts zu steuern. In diesem Experiment betrug das verarbeitete Wasservolumen 10 ml, was wir in einer früheren Studie gezeigt haben, um äquivalente Ergebnisse zu liefern wie die gleiche Anzahl von Bakterien in einem Probenvolumen von 100 ml22. Der Assay wurde insgesamt 5 Stunden lang durchgeführt, aufgeteilt in eine 2-stündige Bakterienerholungsphase, gefolgt von einer 3-stündigen Phageninfektion, um sicherzustellen, dass die Zellen genügend Zeit haben, das NanoLuc-Reporterenzym zu produzieren.

Anhand unserer Ergebnisse beobachten wir ein deutliches Signal über dem Hintergrund für beide getesteten Proben mit 9 KBE und für eine von zwei Proben mit 8 KBE (Abb. 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass wir mit einem 4-Phagen-Cocktail bereits weniger als 10 E. coli-KBE pro 100 ml Wasser messen können. Beachten Sie außerdem, dass das hier als Referenzmethode verwendete Filtrationstestkit das Vorhandensein von thermotoleranten Kolibakterien und nicht speziell E. coli nachweist, was nur etwa 80 % der thermotoleranten Kolibakterien ausmacht34, 35. Darüber hinaus gibt es etwa 15 bis 20 Mal mehr nicht-bakterielle Bakterien. E. coli-Bakterien in den Proben, bestimmt durch Gesamtkeimzahl, durchgeführt vom AgriQ Quest Laboratory in Nairobi, wo wir die Proben verarbeitet haben, und die relative Häufigkeit der Gattung Escherichia/Shigella in der Bakterienpopulation von Fäkalienschlamm wird auf 0,1–0,8 % geschätzt 36. Dies weist darauf hin, dass der Assay keine Nicht-E. coli-Bakterien nachweist und dass der Wirtsbereich der Phagen spezifisch für E. coli ist. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Experimenten beobachtet, die mit Flussproben in einem 96-Well-Plattenformat durchgeführt wurden, wodurch wir eine größere Anzahl von Proben und Replikaten testen konnten (Abb. S4). Basierend auf diesen vorläufigen Ergebnissen, die bestätigten, dass unsere E. coli-Bibliothek ausreichend vielfältig war, haben wir die Entwicklung des Phagencocktails weiter vorangetrieben, um einen potenziell robusteren Assay mit einem größeren Wirtsbereich und einer niedrigeren Nachweisgrenze zu entwickeln. Beachten Sie, dass zum Zeitpunkt des Tests der Phagen Phi7 Teil des Cocktails war, sich jedoch später herausstellte, dass er die Leistung des Gesamtcocktails nicht steigerte, und dass er zugunsten leistungsfähigerer Phagen entfernt wurde.

Der fertige Phagencocktail, der 8 Phagen enthielt, wurde mit Abwasserproben in Kontakt gebracht, die in einer örtlichen Wasseraufbereitungsanlage (King County South Water Treatment Plant in Renton, WA, USA) gesammelt wurden. Was unsere Feldbewertung des Teilcocktails betrifft, so wurde der Assay mit einem selbst entwickelten Mikrofluidik-Chip durchgeführt, diesmal mit einer aktualisierten Version, die in Abb. 5a dargestellt und in früheren Arbeiten näher beschrieben wurde22. Die neue Version des Mikrofluidikgeräts enthält dieselben Funktionseinheiten wie die Vorgängerversion; Es wurden jedoch kleine Modifikationen vorgenommen, um einen Herstellungsprozess im Spritzgussverfahren zu ermöglichen, was die Gesamtkosten des Tests erheblich reduzierte. Mehrere Verdünnungen der Abwasserprobe wurden entweder doppelt (MPN-Werte > 1000) oder dreifach (MPN-Werte < 1000) hergestellt, um einen Bereich von Zellkonzentrationen für Tests zu erzeugen (Abb. 5b).

Validierung des endgültigen Phagencocktail-Assays an lokalen Abwasserproben. (a) Zweiter Prototyp des Mikrofluidikgeräts zum Nachweis von E. coli in Wasserproben. Maßstabsbalken: 10 mm (b) Lumineszenzsignal normalisiert auf den reinen Phagen-Hintergrund von Abwasserproben, die mit dem 8-Phagen-Cocktail gewonnen und durch das Mikrofluidik-Chip-Gerät verarbeitet wurden. MPN-Werte wurden mit einem Quanti-Tray/2000-Assay bestimmt. Die gepunktete Linie zeigt eine lineare Regression, die für eine Teilmenge der Daten zwischen MPN-Werten von 1 und 100 durchgeführt wurde. Die gestrichelte Linie stellt Werte bei 2× Hintergrund dar.

Die hier präsentierten Daten fassen die Ergebnisse zusammen, die mit Abwasserproben erzielt wurden, die an zwei verschiedenen Tagen gesammelt wurden und bei denen kein Unterschied beobachtet wurde. Der x-Wert < 1 entspricht einem negativen Quanti-Tray/2000-Assay, dem gemäß den Anweisungen des Herstellers ein MPN-Wert (Most Probable Number) von weniger als 1/100 ml zugewiesen wurde. Bei diesen Proben ist das gemessene Lumineszenzsignal mit dem Hintergrundsignal von Nur-Phagen-Kontrollen vergleichbar. Bei einem MPN-Wert von 1 (vom Hersteller angegebenes 95 %-Konfidenzintervall (CI) = 0–3,7) erkennt der Phagentest in nur einer von drei Proben ein Signal, das mehr als zweimal über dem Hintergrund liegt. Bei sehr niedrigen Zellkonzentrationen folgt die Bakterienpopulation einer Poisson-Verteilung37, was erklärt, dass einige der verdünnten Proben möglicherweise Zellen enthalten, andere jedoch möglicherweise nicht. Bei einem MPN-Wert von 6 und einem 95 %-KI = 2,3–12,1, was darauf hinweist, dass die meisten Proben Bakterien enthalten, wird in allen drei Replikaten ein Signal festgestellt, das etwa fünfmal über dem Hintergrund liegt. Wir haben eine lineare Regression nur im unteren Zellzahlbereich (< 100) durchgeführt, um eine einfache Kalibrierungskurve für unseren Test zu zeigen. Dies ermöglicht es uns, Bakterienzahlbereiche basierend auf der mit dem Assay gemessenen Lumineszenzreaktion zu bestimmen: < 1, zwischen 1 und 10, zwischen 10 und 100 und > 100.

Zur Identifizierung kontaminierter Quellen sind schnelle, kostengünstige und feldtaugliche Methoden zum Nachweis des Vorhandenseins von Krankheitserregern in Wasserquellen in ressourcenarmen Umgebungen erforderlich. Die derzeit staatlichen und gemeinnützigen Organisationen zur Verfügung stehenden Methoden, die häufig Tests zur Quantifizierung der E. coli-Kontamination durchführen, umfassen typischerweise lange Inkubationszeiten und komplizierte Prozesse. Darüber hinaus ist eine spezielle Ausbildung erforderlich oder die Proben müssen in einem Labor transportiert und verarbeitet werden. Leider ist dies aufgrund fehlender nahegelegener, notwendiger Infrastrukturen oft nicht umsetzbar.

Die Entwicklung eines schnellen und kostengünstigen Tests zum Nachweis geringer Mengen lebensfähiger E. coli-Bakterien in einer großen Wassermenge (100 ml) hat sich für die wissenschaftliche Gemeinschaft als Herausforderung erwiesen. Frühere Bemühungen waren bei der Entwicklung von Reporterphagen für diese Anwendung erfolgreich18, 38, 39. Leider verwenden die Methoden Laborstämme und Phagen mit sehr begrenzten Wirtsbereichen und Testprotokollen, sodass sie für Feldanwendungen ungeeignet sind. Um diese Lücke zu schließen, haben wir eine Bibliothek von 92 Phagen gescreent, darunter über 50 neuartige Phagen, die für diese Arbeit isoliert wurden, und die Leistung eines Mikrofluidikgeräts validiert, das wir zuvor in unserem Labor an realen Umweltwasserproben von verschiedenen Standorten entwickelt hatten. Unsere Gesamtmethode kombiniert:

Ein Phagencocktail mit einem umfangreichen Wirtsspektrum speziell für E. coli.

Ein enzymatischer Reporter, NanoLuciferase, der in Kombination mit dem NanoGlo-Substrat ein sehr helles Lumineszenzsignal erzeugt, das eine niedrige Nachweisgrenze ermöglicht.

Ein mikrofluidisches Einweggerät, das einen Bakterienkonzentrationsschritt, eine In-situ-Phageninfektion und eine Konzentration des exprimierten Reporters kombiniert, um die Empfindlichkeit des Assays vor dem Nachweis zu erhöhen.

Als ersten Schritt zur Assay-Entwicklung haben wir mehrere Phagen identifiziert und konstruiert, die auf der Grundlage verschiedener Merkmale ausgewählt wurden (Eignung zur Rekombination mit dem NanoLuc-Reporter, Stabilität während und nach Reinigungsprozessen, endgültige Phagenreinheit und -titer, Zeit zur Erzeugung eines Signals, und Intensität des Lumineszenzsignals infolge einer Infektion), die in einem Phagencocktail kombiniert werden sollen. Der Aufbau einer E. coli-Stammbibliothek zur Selektion von Phagen basierte auf der genetischen und geografischen Diversität mit Schwerpunkt auf Stämmen, die in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen isoliert wurden. Der Phagenselektionsprozess basierte auf empirischen Daten, da wir keine Möglichkeit fanden, die Phagenstabilität oder den Erfolg von Reinigungsprozessen vorherzusagen. Bei der Bestimmung des Wirtsbereichs stellten wir fest, dass der Wirtsbereich, der durch den Lumineszenzassay bestimmt wurde, für alle getesteten Phagen breiter ist als bei der Bestimmung durch den Plaqueassay. Wir vermuten, dass dieser Unterschied auf fehlgeschlagene Infektionen zurückzuführen ist40, bei denen eine infizierte Bakterienzelle vorzeitig stirbt und dadurch die Produktion und weitere Vermehrung reifer Phagen verhindert. Während keine anhaltende Infektion entsteht und keine Plaques beobachtet werden, wird das Reporterenzym in Mengen produziert, die hoch genug sind, um nachgewiesen zu werden. Alternativ könnten Modifikationen des Plaque-Assays (z. B. eine geringere Konzentration der Weichagar-Überschichtung) die Plaque-Morphologie beeinflussen und werden weiter untersucht, um zu untersuchen, ob eine Übereinstimmung zwischen den Ergebnissen des Plaque- und des Lumineszenz-Assays erzielt werden kann.

Die Expression des Reporterenzyms wird durch einen konstitutiven Promotor gesteuert und entsteht somit während der Phagenvermehrung. Daher haben wir erhebliche Anstrengungen in die Entwicklung von Reinigungsmethoden gesteckt, um Phagenreagenzien mit hohen Titern und niedriger Reporterkonzentration herzustellen, die kein nennenswertes Hintergrundsignal erzeugen. Nur der Phagen T7 konnte durch aufeinanderfolgende Reinigungsrunden mit Zellulosekügelchen effizient gereinigt werden. Bei dieser Methode binden sich die zellulosebasierten Kügelchen an das zellulosebindende Motiv (CBM), das mit dem NanoLuc-Reporter verschmolzen ist, der dann aus der Lösung entfernt werden kann. Bei allen anderen Phagen würde es zu Titerabfällen kommen oder die Restlumineszenz würde bei unannehmbar hohen Werten stagnieren, da ein erheblicher Teil der NanoLuc-Proteine nicht an die Kügelchen bindet und enzymatisch aktiv bleibt. Auf Größenausschluss basierende Methoden wie die Tangentialflussfiltration erwiesen sich in diesen Fällen als wirksam und ermöglichten uns die Verarbeitung großer Volumina.

Bei Assays zur Messung lebensfähiger Bakterien gibt es normalerweise einen Kompromiss zwischen der Zeit bis zum Nachweis und der Nachweisgrenze, da Bakterien, die eine Phase der Erholung und des Wachstums durchlaufen, ein höheres Signal erzeugen. Es wird erwartet, dass sich Bakterienzellen, die aus Umweltwasserproben entnommen wurden, in einem Ruhezustand befinden, da die Wasserumgebung nährstoffarm ist und eine niedrigere Temperatur aufweist als der Verdauungstrakt von Säugetieren. Wenn Bakterienzellen in der stationären Phase in ein nährstoffreiches Medium bei optimaler Temperatur gegeben werden, treten die Zellen zunächst in eine Verzögerungsphase ein, eine anfängliche Zeitspanne, in der sich die Zellen an ihre neue Umgebung anpassen und sich auf exponentielles Wachstum vorbereiten41. Damit Zellen das Reporterenzym effektiv exprimieren können, möchten wir sicherstellen, dass die Zellen in die exponentielle Wachstumsphase eingetreten sind, in der Proteine in hohen Mengen exprimiert werden. Basierend auf früheren Studien, die mit dem Mikrofluidikgerät22 durchgeführt wurden, war ein Zeitraum von 1 bis 2 Stunden zur Erholung des Zellstoffwechsels die minimale Zeitspanne, die erforderlich war, um eine wirksame Phageninfektion sicherzustellen. Da wir davon ausgehen, dass die Wasserproben verschiedene Bakterienstämme mit möglicherweise unterschiedlichen Erholungszeiten enthalten, haben wir eine Inkubationszeit von 2 Stunden vor der Phageninfektion gewählt. Anschließend bestimmten wir die Zeit bis zur Beobachtung der maximalen Signalerzeugung nach einer Phageninfektion. Mit dem Cocktail aus 8 Phagen und einem Laborstamm beobachten wir eine maximale Signalerzeugung nach einer 2-stündigen Phageninfektion, die bei längeren Infektionszeiten ein Plateau erreicht. Da wir keine negativen Auswirkungen längerer Infektionszeiten beobachten und davon ausgehen, dass die Phagen eine nicht charakterisierte Bakterienpopulation aus Umweltproben infizieren, haben wir einen Infektionszeitraum von 3 Stunden gewählt, was zu einer Gesamtinkubationszeit des Assays von 5 Stunden führt.

Wir haben die Leistung des Assays bewertet und unsere Phagenselektionsmethode zu Beginn der Entwicklung validiert, indem wir den Assay an realen Proben in Nairobi, Kenia, getestet haben, einem Ort, an dem dieses Produkt verwendet werden sollte. Diese Bewertung ist entscheidend für die ordnungsgemäße Beurteilung der Cocktailleistung und die Gewährleistung der Gültigkeit unserer Phagenselektionsmethode. Zum Zeitpunkt dieser Bewertung enthielt der Phagencocktail vier Phagen (Phi3, Phi7, RB69 und T7). Mit nur 4 Phagen schnitt der Assay bei diesen Umweltproben sehr gut ab und detektierte weniger als 10 E. coli MPN/100 ml. Darüber hinaus beobachteten wir bei Proben, die 1 oder weniger thermotolerante coliforme KBE enthielten, nur ein geringes Signal gegenüber dem Hintergrund, was darauf hindeutet, dass der Test spezifisch für E. coli ist. Insgesamt zeigten die Ergebnisse, dass unsere hauseigene E. coli-Bibliothek es uns ermöglicht, Phagen mit Wirtsbereichen auszuwählen, die nicht nur spezifisch für unsere E. coli-Bibliothek sind und die ein breites Spektrum an Bakterien infizieren. Basierend auf diesen Ergebnissen haben wir die Entwicklung des Phagencocktails und des Tests vorangetrieben. Beachten Sie, dass bei der schrittweisen Zugabe neuer Phagen zum Cocktail keine hemmenden Wirkungen beobachtet wurden; Daher ist ein Cocktail mit einer höheren Anzahl an Phagen wünschenswert, da er die Wahrscheinlichkeit erhöht, empfindliche E. coli-Stämme in einer Wasserprobe zu finden.

In einer örtlichen Wasseraufbereitungsanlage wurden Wasserproben entnommen, um die Leistung des phagenbasierten Assays und die Zusammensetzung des Phagencocktails an komplexen Bakterienproben und dem Mikrofluidik-Chip-Gerät weiter zu validieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Methode E. coli-Bakterienzellen bis zu 6 E. coli MPN in 5,5 Stunden (Gesamtzeit einschließlich Inkubationszeiten, Filtration und Reporterkonzentrationsschritten) erkennt, gemessen im Vergleich zur Quanti-Tray/2000-Referenzmethode. Darüber hinaus variiert das Signal linear mit der Bakterienzahl, die an eine Kalibrierungskurve angepasst werden kann. Dadurch können Kontaminationsgrade bestimmt werden: < 1 E. coli MPN/100 ml (keine bis sehr geringe Kontamination), 1–10 E. coli MPN/100 ml (geringe Kontamination), 10–100 E. coli MPN/100 ml ( hohe Kontamination) und > 100 E. coli MPN/100 ml (sehr hohe Kontamination). Diese Kalibrierungskurve hängt von der Qualität der Phagenreagenzien (Titer, Reinheit) ab und müsste für jede Phagencocktail-Produktionscharge ermittelt werden.

Zur Verwendung mit dem Mikrofluidik-Chip-Gerät hat unser Labor ein Instrument entwickelt, das es einem Benutzer mit minimaler Schulung ermöglicht, den phagenbasierten Assay durchzuführen. Das Design des Instruments und der Software wurden in unserer vorherigen Veröffentlichung von Alonzo et al.22 zur Verfügung gestellt. Zusammen mit diesem Instrument schlagen wir eine Komplettlösung vor, um im Feld in 5,5 Stunden gezielt weniger als 10 lebensfähige E. coli MPN/100 ml zu messen und gleichzeitig relevante E. coli-Bakterienkontaminationsgrade unter 1/100 ml zwischen 1 und 1 zu unterscheiden und 10/100 ml, zwischen 10 und 100/100 ml und über 100/100 ml, zu ähnlichen Kosten wie bestehende Feldtestkits.

Um den Fernzugriff zu erleichtern, passen Prototypen in einen kleinen Pelican-Koffer in Handgepäckgröße, sind leicht und können batteriebetrieben werden. Die Weiterentwicklung des Instrumentierungsprototyps zur Automatisierung und Erhöhung des Durchsatzes wird Tests an entfernten Standorten durch nur minimal geschulte Benutzer ermöglichen. Zusätzliche Entwicklungsanstrengungen zur Stabilität und Verpackung von Reagenzien, insbesondere zur Lyophilisierung von Phagen und Substratlösungen, sind von Interesse, um die Aussicht auf ein tragbares System zu verbessern. Tests des Assays an natürlichen Gewässern an verschiedenen Orten werden notwendig sein, um die Phagenauswahl zu verfeinern, um eine robuste Cocktailzusammensetzung zu erzeugen und eine hohe Empfindlichkeit und Spezifität zu erreichen. Alternativ haben gezielte genetische Modifikationen von Phagenschwanzkomponenten, die am anfänglichen Bindungsereignis beteiligt sind, das Wirtsspektrum erfolgreich erweitert42. Diese Strategien können auch zur Entwicklung spezifischer Bakteriophagen genutzt werden, die auf den Nachweis anderer Krankheitserreger und Indikatoren in anderen Flüssigkeitsproben wie Urin oder Getränken abzielen.

Unsere Bakteriensammlung besteht aus 339 E. coli-Stämmen, darunter 72 Stämme, die die von der Michigan State University erworbene ECOR-Bibliothek33 repräsentieren, 116 Stämme, die vom E. coli-Referenzzentrum am Penn State University College of Agricultural Sciences erworben wurden, und 151 aus Wasserproben isolierte Stämme in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen (LMIC) aus verschiedenen Wasserquellen (Flüsse, Brunnen und stehende Gewässer) gesammelt. Gesammelte Wasserproben von LMIC wurden durch 0,45-µm-Membranen (Millipore HAWP04700) gefiltert, die dann auf MLGA-Selektivmedienplatten (Sigma Nr. 39734) platziert und 4 Stunden lang bei 30 °C und anschließend 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert wurden. Bis zu 10 E. coli-Kolonien pro Wasserquelle wurden gesammelt und ausgestrichen, um sie von möglichen Verunreinigungen zu isolieren. Ausgewählte Stämme wurden in TSB (Trypic-Soja-Brühe) gezüchtet und bei –80 °C gelagert.

Unsere Phagensammlung besteht aus 92 lytischen Phagen, darunter 39 von der Université Laval, QC, erworbene Phagen und 53 Coliphagen (mit TH-# gekennzeichnet), die aus Abwasserproben isoliert wurden, die in einer örtlichen Wasseraufbereitungsanlage (King County, Department of Natural Resources and Parks, Wastewater) gesammelt wurden Behandlungsabteilung) wie zuvor beschrieben43. Kurz gesagt, Rohabwasser (25 ml) wurde mit 2 × LB (Luria-Brühe) (25 ml) und einer Übernachtkultur von E. coli-Wirtszellen (500 µL) in einem 150-ml-Kolben gemischt. Nach Inkubation über Nacht (37 °C, 250 U/min), Zentrifugation (3000 × g, 10 Min.) und Filtration (0,22 µm) der Kultur ergab der Überstand ein Phagenlysat, das anschließend dreimal am ursprünglichen Wirtsstamm Plaque-gereinigt wurde um einen homogenen Phagenstamm zu erzeugen. Die Genome isolierter Phagen wurden in einem Illumina Miseq vollständig sequenziert, wie an anderer Stelle beschrieben43. Die Phagen wurden in der Nugen-Sammlung der Cornell University hinterlegt.

Der Wirtsbereich jedes Phagen aus unserer Sammlung wurde durch einen Double-Overlay-Plaque-Assay (LB-Agar und 0,8 % weiches LB-Agar-Overlay)44 an einem begrenzten Satz von Bakterien, bestehend aus 36 Stämmen aus der ECOR-Bibliothek (ECOR Nr. 1 bis Nr. 36), bestimmt ) und 43 Bakterien, die aus Umweltwasserproben isoliert wurden.

Restriktionsenzyme, T4-DNA-Ligase, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix und NEB 5-alpha-kompetente E. coli-Zellen wurden bei New England Biolabs, Inc. bestellt. Die in dieser Studie verwendeten Oligonukleotide wurden von IDT synthetisiert. Das Plasmid, das S. pyogenes Cas9 (pCas9) exprimiert, wurde freundlicherweise von Sam Nugen, Cornell University, zur Verfügung gestellt. Das Plasmid, das das Codon-optimierte NanoLuc®-Luciferase-Gen von E. coli exprimiert und über einen flexiblen Linker (pUC57-NanoLuc) mit einem C-terminalen CBM2a45 verknüpft ist, sowie die Plasmide, die 3 × gRNA exprimieren und auf bestimmte Regionen im Phagen abzielen, wurden von GenScript synthetisiert. Phagensequenzen wurden entweder von NCBI heruntergeladen oder intern auf einem Illumina MiSeq sequenziert, wie an anderer Stelle beschrieben43. Die Sequenzen wurden mit der Geneious-Software (Version 11.1.5, Biomatters Ltd., Auckland, Neuseeland)46 zusammengestellt und mit anderen Genomen unter Verwendung von NCBI BLAST47, PSI-BLAST48 und Clustal Omega49 verglichen.

Das Phagen-Engineering wurde in vivo unter Verwendung des CRISPR-Cas9-Systems durchgeführt, wie zuvor beschrieben, in einem Stamm mit der Fähigkeit zur homologen Rekombination50. Phagenspezifisches Donorplasmid wurde durch zweistufige Klonierung in NEB 5-alpha erzeugt. Zunächst wurden 600–1500 bp der linken und rechten Homologieregionen (LHR und RHR) unter Verwendung von Phagen-DNA als Matrize amplifiziert und mithilfe des NEBuilder HiFi-Assembly-Mix-Protokolls vor und nach der NanoLuc-CBM-Kassette kloniert. Die funktionelle crRNA-Leadersequenz und die 3 × gRNA-Kassette wurden dann in ihr jeweiliges phagenspezifisches Plasmid kloniert, um das endgültige Donorplasmid zu konstruieren. Alle verwendeten Primerpaare und gRNA-Sequenzen sind in den Tabellen S1 und S2 aufgeführt. 100 ng pCas9 und phagenspezifisches Donorplasmid wurden nacheinander in DY331 unter Standardbedingungen elektroporiert. Der erfolgreich transformierte DY331-Stamm wurde vorübergehend für Pro-Rekombinations-Lambda-Rot-Gene induziert, wie an anderer Stelle beschrieben51. Anschließend wurden die Stämme zur In-vivo-Rekombination mit dem entsprechenden Phagen (Titer 104 bis 109) infiziert und auf Weichagar gegossen.

Nano-Glo® (Promega, Madison, WI), hergestellt gemäß den Anweisungen des Herstellers, wurde gleichmäßig auf die Platten gesprüht und abgebildet, um nach leuchtenden rekombinanten Phagen-Plaques zu suchen. Rekombinante Phagen wurden in PBS-Puffer (1 ml) gepickt und zehnfache Reihenverdünnungen wurden dreimal auf ihren jeweiligen Wirt ausplattiert, um die rekombinanten Phagen zu reinigen. Alle rekombinanten Phagen wurden durch Sequenzierung bestätigt. Für T7 wurde der Reporterphage durch Zusammensetzen überlappender PCR-Fragmente des T7-Phagengenoms und der Reporter-Expressionskassette konstruiert. Jedes benachbarte Fragment weist eine Homologie von ≥ 30 bp auf. Die zur Amplifikation des T7-Genoms verwendeten Primer und die Insertionsstelle der Reporterkassette sind wie zuvor beschrieben52. Der rekombinante TH07-Phage wurde ausgewählt, indem der Wildtyp-Phage auf einen Stamm plattiert wurde, der Allelaustauschsubstrat enthielt, und wie oben beschrieben auf leuchtende Plaques gescreent wurde.

Rekombinante Phagen wurden in Flüssigkultur nach früheren Methoden vermehrt53. Übernachtkulturen von Wirtszellen (NEB 5-alpha) wurden in TSB-Medium, ergänzt mit Tween 80 (0,05 %), verdünnt (1:100). Wirtszellen wurden inkubiert (37 °C, 250 U/min, OD600 = 0,15), mit einer Phagen-Stammlösung (MOI = 0,1) beimpft und weiter inkubiert (37 °C, 250 U/min, 3–5 Stunden), um einen hohen Titer zu erzeugen Phagenlysat. Das Lysat wurde zentrifugiert (3750 × g, 10 min), um Zelltrümmer zu pelletieren, und der Überstand wurde vor der Lagerung bei 4 °C filtriert (0,22 μm, EMD Millipore, Burlington, MA, USA). Die Phagenlösungen wurden gereinigt, um während der Vermehrung exprimiertes NanoLuc zu entfernen. Zellulosekügelchen (Avicel, PH-101, ~ 50 µm, Millipore Sigma, Darmstadt, Deutschland) wurden zu Phagenlysaten gegeben (5 g pro 100 ml, 30 min, 250 U/min, 37 °C), um den Reporter zu binden, und durch Filtration entfernt (0,22 µm) vor der Tangentialflussfiltration (TFF). Teilweise gereinigte Phagenlysate (50 ml) wurden zu SM-Puffer (50 mM Tris-HCl, 8 mM Magnesiumsulfat, 100 mM Natriumchlorid, 0,01 % Gelatine, pH 7,5) mit 0,05 % Tween 80 (450 ml) gegeben und auf den Puffer gegeben Minimate-TFF-System (Pall Biotech, New York, NY, USA) mit einer 500-kDa-Cutoff-Membran. Es wurde eine kontinuierliche Diafiltration durchgeführt, bis die Lumineszenzwerte des Retentats ein Plateau erreichten. Die gereinigte Phagenlösung wurde dann auf ihr ursprüngliches Volumen konzentriert, von der Membran gewonnen und bei 4 °C gelagert. Das Reinigungsverfahren für den Phagen T7 bestand aus aufeinanderfolgenden Zellulosewäschen (5 g pro 100 ml, Sterilfiltration, 5–7 Mal wiederholen), bis die Lumineszenzwerte ein Plateau erreichten. Phagen-Stammlösungen mit hohem Titer (> 109 PFU/ml) wurden mit Natriumazid (0,05 %) behandelt, um eine Phagen-Stammlösung zur Lagerung zu erzeugen. Schließlich wurde eine Phagen-Cocktail-Lösung durch Mischen von Stammlösungen von acht Phagen in TSB (jeweils mit einer Endkonzentration von 1:80 vom Stamm) hergestellt und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert. Die Phagentiter waren mindestens 6 Monate lang stabil.

Der Wirtsbereich der rekombinanten Phagen wurde anhand der gesamten E. coli-Bibliothek (339 Stämme) in einem Multiwell-Plattentest bewertet. Über Nacht wurde eine E. coli-Kultur (7,5 µL) zu TSB (117,5 µL) in einer Standardplatte mit 96 Vertiefungen gegeben und inkubiert (37 °C, 1,5 Stunden, 100 U/min). Eine Phagenlösung in TSB-Puffer (25 µL) mit hohem Titer (> 108 PFU/ml) wurde in die entsprechenden Vertiefungen gegeben (endgültige Vertiefungszusammensetzung: TSB mit 10 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 50 mM Tris-HCl pH 7,5). Die Platte wurde weitere 3 Stunden lang inkubiert, danach wurden 100 µL der Kultur auf eine weiße 96-Well-Platte übertragen, 1:1 mit NanoGlo-Substrat gemischt und 3 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie mit einem Plattenlesegerät abgelesen wurden ( BioTek Synergy H1, 1 mm Lesehöhe, 1 s Integration).

Eine Übernachtkultur von ATCC 25922 wurde seriell in PBS verdünnt, um Lösungen zu ergeben, die zwischen 1 und 1000 E. coli-Bakterien/ml enthielten, gemessen mit der Most Probable Number (MPN)-Technik unter Verwendung eines Quanti-Tray/2000-Systems, in dreifacher Ausfertigung. Jede Verdünnung (40 µl) wurde in acht Replika-Wells einer 96-Well-PVDF-Filterplatte (Corning) gegeben und filtriert, um die Bakterien zu sammeln. Anschließend wurde jeder Vertiefung TSB (90 µL) zugesetzt und die Platte inkubiert (37 °C, 2 Stunden). Die Phagencocktaillösung (10 µL) wurde in die entsprechenden Vertiefungen gegeben und die Platte wurde 1, 1,5, 2 oder 2,5 Stunden lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Lösung filtriert und der NanoLuc-Reporter gesammelt. Die Filtratlösung wurde auf eine weiße Zellulosefilterplatte mit 384 Vertiefungen (Pall, Acroprep) gegeben und erneut filtriert, um den Reporter auf der Nitrozellulosemembran zu sammeln und zu konzentrieren. In jede Vertiefung wurde Nano-Glo-Substrat (10 µL) gegeben und die Lumineszenz wurde wie zuvor beschrieben gemessen.

Ein mikrofluidisches Gerät zur Bakterienerkennung wurde intern entwickelt und für die Herstellung ausgelagert (HC 1101-001, Hochuen Medical Technology, Shenzhen, China). Eine vollständige Beschreibung des mikrofluidischen Geräts finden Sie in einer separaten Studie22. Kurz gesagt besteht das Gerät aus zwei miteinander verbundenen Funktionsmerkmalen: (1) einem Filterbereich mit geringer Proteinbindung, der dazu dient, Bakterien aus Umgebungswasserproben zu isolieren und zu züchten, gefolgt von einer In-situ-Cocktail-Phageninfektion, und (2) einem Sammel- und Aktivierungsbereich auf Zellulosebasis für Phagen-induziertes Lumineszenz-Reporterenzym.

Wasserproben (≥ 100 ml) in Nairobi, Kenia, wurden am Ngong-Fluss entlang des Mukuru Kayaba-Gebiets gesammelt und zu einem nahegelegenen Labor transportiert. Abwasserproben (≥ 100 ml) wurden in einer örtlichen Einrichtung gesammelt. Die Trübung wurde mit dem Trübungsmessgerät HTTURB® (Wagtech Projects Ltd., Thatcham, UK) gemessen und die Proben wurden zur Verarbeitung mit dem Mikrofluidikgerät auf 1 NTU verdünnt. Die Proben wurden weiter seriell in destilliertem Wasser verdünnt, um verschiedene Zellkonzentrationen für die Tests zu erzeugen. Die gewünschte Verdünnung (100 ml) wurde mithilfe einer speziell angefertigten Filterbaugruppe mit einer Spritze, die mit dem Mikrofluidikchip verbunden war, zu TSB-Medium (10 ml) hinzugefügt. Während des Filtrationsprozesses wurde an der Auslassöffnung Vakuum angelegt, wodurch alle Partikel, die größer als 0,45 µm waren – einschließlich E. coli-Zellen – auf einer PVDF-Membran eingefangen wurden. Um die Stoffwechselaktivität der isolierten Zellen zu erhöhen, wurde die Serpentinenkanalkammer über der PVDF-Membran mit TSB-Medium (250 µL) gefüllt, das Tween 20 (0,1 %) enthielt. Anschließend wurde der Chip in einem Laborinkubator (37 °C, 2 h) inkubiert. Anschließend wurde das Medium durch eine Phagencocktaillösung bei > 107 (250 µL) ersetzt. Der Chip wurde weiter inkubiert (37 °C, 3 Stunden), um eine Phageninfektion zu ermöglichen. Anschließend wurde Vakuum angelegt, um das produzierte NanoLuc-CBM-Enzym von der PVDF-Membran auf die Nitrozellulose (NT)-Einfangmembran zu übertragen. Schließlich wurde Nano-Glo-Substrat (75 µL) in die Kammer unterhalb der NT-Membran gegeben. Die Lumineszenz wurde sofort mithilfe einer speziell angefertigten Detektionsanordnung mit einer Photomultiplierröhre (ET Enterprises, Ltd., Uxbridge, UK)22 abgelesen. Das Membranfiltrationskit Aquasafe® WSL50 Pro (Wagtech Projects Ltd., Thatcham, UK) wurde zur Quantifizierung der KBE in den Flussproben verwendet, und das Quanti-Tray/2000-System (IDEXX, Westbrook, ME) wurde zur Bestimmung der MPN im Abwasser verwendet Proben.

Vereinte Nationen. Nachhaltiges Entwicklungsziel 6: Synthesebericht zu Wasser und Sanitärversorgung. Vereinte Nationen https://doi.org/10.1126/science.278.5339.827 (2018).

Artikel Google Scholar

Interinstitutionelle Gruppe der Vereinten Nationen für Kindersterblichkeit. Niveaus und Trends der Kindersterblichkeit. (2019).

Weltgesundheitsorganisation. Richtlinien für Trinkwasser. (2017). https://www.who.int/water_sanitation_health/publications/drinking-water-quality-guidelines-4-inklusive-1st-addendum/en/

Odonkor, ST & Ampofo, JK Escherichia coli als Indikator für die bakteriologische Qualität von Wasser: ein Überblick. Mikrobiol. Res. (Pavia) 4, 5–11 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Rompre, A., Servais, P., Baudart, J., De-Roubin, M.-R. & Laurent, P. Nachweis und Zählung von Kolibakterien im Trinkwasser: Aktuelle Methoden und neue Ansätze. J. Mikrobiol. Methoden 49, 31–54 (2002).

Artikel PubMed Google Scholar

Bain, R. et al. Ein zusammenfassender Katalog mikrobieller Trinkwassertests für Umgebungen mit geringen und mittleren Ressourcen. Int. J. Umgebung. Res. Public Health 9, 1609–1625 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Nurliyana, M. et al. Die Nachweismethode von Escherichia coli in Wasserressourcen: Ein Überblick. J. Phys 995, 12065 (2018).

Google Scholar

UNICEF. UNICEF TPP: Rapid E. coli Detection v3. 1–16 (2019). https://www.unicef.org/innovation/sites/unicef.org.innovation/files/2020-10/Rapid-coli-detection-TPP-2019.pdf

Richter, Ł, Janczuk-Richter, M., Niedziółka-Jönsson, J., Paczesny, J. & Hołyst, R. Jüngste Fortschritte bei Bakteriophagen-basierten Methoden zum Nachweis von Bakterien. Arzneimittelentdeckung. Heute 23, 448–455 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Paczesny, J., Richter, Ł & Hołyst, R. Jüngste Fortschritte beim Nachweis von Bakterien mithilfe von Bakteriophagen: Eine Übersicht. Viren 12, 845 (2020).

Artikel CAS PubMed Central Google Scholar

Ackermann, H.-W. & DuBow, MS in Viruses Prokaryotes General Properties of Bacteriophages, Bd. 1 49–85 (CRC Press, 1987).

Loessner, MJ, Rees, CED, Stewart, GSAB & Scherer, S. Konstruktion des Luciferase-Reporterbakteriophagen A511::luxAB für den schnellen und empfindlichen Nachweis lebensfähiger Listeria-Zellen. Appl. Umgebung. Mikrobiol. 62, 1133–1140 (1996).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jain, P. et al. φ 2GFP10, ein hochintensiver Fluorophage, ermöglicht den Nachweis und die schnelle Prüfung der Arzneimittelempfindlichkeit von Mycobacterium tuberculosis direkt aus Sputumproben. J. Clin. Mikrobiol. 50, 1362–1369 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, S., Kim, M. & Ryu, S. Entwicklung eines gentechnisch veränderten biolumineszierenden Reporterphagen für den empfindlichen Nachweis lebensfähiger Salmonella typhimurium. Anal. Chem. 86, 5858–5864 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Alcaine, SD et al. Phagen-Protease-Peptid: Ein neuartiges Trifecta, das den Multiplex-Nachweis lebensfähiger bakterieller Krankheitserreger ermöglicht. Appl. Mikrobiol. Biotechnologie. 99, 8177–8185 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alcaine, S., Pacitto, D., Sela, D. & Nugen, S. Phagen und Phosphatase: Eine neuartige phagenbasierte Sonde für den schnellen, plattformübergreifenden Nachweis von Bakterien. Analyst 140, 7629–7636 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Ripp, S., Jegier, P., Johnson, CM, Brigati, JR & Sayler, GS Bakteriophagen-verstärkte Biolumineszenzerkennung von Escherichia coli O157:H7. Anal. Bioanal. Chem. 391, 507–514 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hinkley, TC et al. Ein phagenbasierter Assay für die schnelle, quantitative und einzelne CFU-Visualisierung von E. coli (ECOR #13) in Trinkwasser. Wissenschaft. Rep. 8, 1–8 (2018).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Hinkley, TC et al. Der Reporter-Bakteriophage T7NLC nutzt eine neuartige NanoLuc::CBM-Fusion für den ultraempfindlichen Nachweis von Escherichia coli in Wasser. Analyst 143, 4074–4082. https://doi.org/10.1039/C8AN00781K (2018).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Zhang, D. et al. Die Verwendung eines neuartigen NanoLuc-basierten Reporterphagen zum Nachweis von Escherichia coli O157:H7. Wissenschaft. Rep. 6, 33235 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hall, MP et al. Entwickelter Luciferase-Reporter aus einer Tiefseegarnele unter Verwendung eines neuartigen Imidazopyrazinon-Substrats. ACS Chem. Biol. 7, 1848–1857 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Alonzo, LF et al. Ein mikrofluidisches Gerät und Instrumentenprototypen zum Nachweis von Escherichia coli in Wasserproben mithilfe eines phagenbasierten Biolumineszenzassays. Laborchip https://doi.org/10.1039/D1LC00888A (2022).

Artikel PubMed Google Scholar

Ishii, T. & Yanagida, M. Molekulare Organisation der Schale des Teven-Bakteriophagenkopfes. J. Mol. Biol. 97, 655–660 (1975).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tanji, Y. et al. Escherichia coli-Nachweis durch GFP-markierte Lysozym-inaktivierte T4-Bakteriophagen. J. Biotechnologie. 114, 11–20 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Abrescia, NGA et al. Einblicke in den Zusammenbau aus der Strukturanalyse des Bakteriophagen PRD1. Natur 432, 68–74 (2004).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Parks, RJ Adenovirus-Protein IX: Ein neuer Blick auf ein altes Protein. Mol. Dort. 11, 19–25 (2005).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Effantin, G., Boulanger, P., Neumann, E., Letellier, L. & Conway, JF Die Struktur des Bakteriophagen T5 weist Ähnlichkeiten mit HK97 und T4 auf, was auf evolutionäre Beziehungen hindeutet. J. Mol. Biol. 361, 993–1002 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tang, L., Gilcrease, EB, Casjens, SR & Johnson, JE Hochdiskriminierende Bindung von Kapsid-zementierenden Proteinen im Bakteriophagen L. Structure 14, 837–845 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Duong, MM, Carmody, CM, Ma, Q., Peters, JE & Nugen, SR Optimierung des T4-Phagen-Engineerings über CRISPR/Cas9. Wissenschaft. Berichte 10, 1–9 (2020).

Google Scholar

Doudna, JA & Charpentier, E. Die neue Grenze der Genomtechnik mit CRISPR-Cas9. Science 346, 1258096. https://doi.org/10.1126/science.1258096 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. & Marraffini, LA RNA-gesteuerte Bearbeitung von Bakteriengenomen mithilfe von CRISPR-Cas-Systemen. Nat. Biotechnologie. 31, 233–239 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Callahan, DJ, Stanley, B. & Li, Y. Kontrolle der Proteinpartikelbildung während der Ultrafiltration/Diafiltration durch Grenzflächenschutz. J. Pharm. Wissenschaft. 103, 862–869 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ochman, H. & Selander, RK Standard-Referenzstämme von Escherichia coli aus natürlichen Populationen. J. Bakteriol. 157, 690–693 (1984).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garcia-Armisen, T., Prats, J. & Servais, P. Vergleich kultivierbarer fäkaler Kolibakterien und Escherichia coli-Zählung in Süßwasser. Dürfen. J. Mikrobiol. 53, 798–801 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hachich, EM et al. Vergleich der Dichten thermotoleranter Kolibakterien und Escherichia coli in Süßwasserkörpern. Braz. J. Mikrobiol. 43, 675–681 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Numberger, D. et al. Charakterisierung von Bakteriengemeinschaften im Abwasser mit verbesserter taxonomischer Auflösung durch vollständige 16S-rRNA-Sequenzierung. Wissenschaft. Berichte 9, 1–14 (2019).

CAS Google Scholar

Koyama, K., Hokunan, H., Hasegawa, M., Kawamura, S. & Koseki, S. Folgen die Bakterienzellzahlen einer theoretischen Poisson-Verteilung? Vergleich experimentell ermittelter Einzelzellzahlen mit Zufallszahlengenerierung mittels Computersimulation. Lebensmittelmikrobiol. 60, 49–53 (2016).

Artikel PubMed Google Scholar

Burnham, S. et al. Auf dem Weg zum schnellen Phagen-vermittelten Vor-Ort-Nachweis von generischen Escherichia coli in Wasser mittels Lumineszenz- und visueller Anzeige. Anal. Bioanal. Chem. 406, 5685–5693 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chen, J. et al. Elektrochemische Nanopartikel-Enzym-Sensoren zum Screening bakterieller Kontaminationen in Trinkwasser. Analyst 140, 4991–4996 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Seed, KD Kampf gegen Phagen: Wie Bakterien sich gegen Virusangriffe verteidigen. Plus Pathog. 11, e1004847 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Wade, HE Beobachtungen an den Wachstumsphagen von E. coli vom amerikanischen Typ BJ Gen. Microbiol. 7, 18–23 (1952).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ando, H., Lemire, S., Pires, DP & Lu, TK Entwicklung modularer viraler Gerüste für die gezielte Bearbeitung von Bakterienpopulationen. Zellsystem 1, 187–196 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hinkley, TC et al. Genomsequenzen von 38 Bakteriophagen, die Escherichia coli infizieren, isoliert aus Rohabwasser. Mikrobiol. Ressource. Ankündigung 9, 1–3 (2020).

Artikel Google Scholar

Elizabeth, K. & Sulakvelidze, A. Bakteriophagen: Biologie und Anwendungen. (2005).

McLean, BW et al. Analyse der Bindung des Kohlenhydratbindungsmoduls der Familie 2a von Cellulomonas fimi Xylanase 10A an Cellulose: Spezifität und Identifizierung funktionell wichtiger Aminosäurereste. Protein Eng. Des. Sel. 13, 801–809 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Kearse, M. et al. Geneious Basic: Eine integrierte und erweiterbare Desktop-Softwareplattform für die Organisation und Analyse von Sequenzdaten. Bioinformatik 28, 1647–1649 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ Einfaches Suchwerkzeug für die lokale Ausrichtung. J. Mol. Biol. 215, 403–410 (1990).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Altschul, SF et al. Gapped BLAST und PSI-BLAST: Eine neue Generation von Proteindatenbank-Suchprogrammen. Nukleinsäuren Res. 25, 3389–3402 (1997).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sievers, F. et al. Schnelle, skalierbare Generierung hochwertiger Protein-Mehrfachsequenz-Alignments mit Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7, 539 (2011).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Tao, P., Wu, X., Tang, W., Zhu, J. & Rao, V. Engineering des Bakteriophagen-T4-Genoms unter Verwendung von CRISPR-Cas9. ACS Synth. Biol. 6, 1952–1961. https://doi.org/10.1021/acssynbio.7b00179 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yu, D. et al. Ein effizientes Rekombinationssystem für das Chromosomen-Engineering in Escherichia coli. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. 97, 5978–5983 (2000).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pulkkinen, EM, Hinkley, TC & Nugen, SR Nutzung der In-vitro-DNA-Assemblierung zur Entwicklung eines synthetischen T7-Nanoluc-Reporterphagen für den Escherichia coli-Nachweis. Integr. Biol. 11, 63–68 (2019).

Artikel Google Scholar

Bakteriophagen. Humana Press 501, (Humana Press, 2009).

Referenzen herunterladen

Die Autoren danken dem Bill and Melinda Gates Foundation Trust für sein Sponsoring durch den Global Good Fund I, LLC (www.globalgood.com) von Intellectual Venture, der Wasseraufbereitungsanlage King County South in Renton, WA, USA für die Bereitstellung von Abwasserproben und AgriQ Quest Laboratory in Nairobi für die Bereitstellung von Laborräumen.

Luis F. Alonzo, Spencer Garing, Ethan Spencer und Anne-Laure M. Le Ny

Aktuelle Adresse: Global Health Labs, 14360 Eastgate Way, Bellevue, WA, 98007, USA

Paras Jain & David Bell

Aktuelle Adresse: Cell Therapy and Cell Engineering Facility, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, NY, 10065, USA

Sam Nugen

Derzeitige Adresse: Independent Consultant, Issaquah, WA, 98027, USA

Intellectual Ventures Laboratory, 14360 SE Eastgate Way, Bellevue, WA, 98007, USA

Luis F. Alonzo, Paras Jain, Troy Hinkley, Nick Clute-Reinig, Spencer Garing, Ethan Spencer, Van TT Dinh, David Bell, Kevin P. Nichols und Anne-Laure M. Le Ny

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

LFA und A.-LLN haben das Manuskript mit Unterstützung von PJ, NC-R., SG und TH verfasst. PJ und TH stellten die rekombinanten Phagen her. NC-R. führte die Experimente zum Phagen-Wirtsbereich durch. SG und TH pflegten und reinigten die Phagen mit Hilfe von ES. ES hat Abwasserproben entnommen. LFA führte die Experimente an den Mikrofluidik-Chips durch. VD, DB und SN waren an der Planung des Projekts beteiligt. A.-LLN betreute das Projekt zusammen mit KN. Alle Autoren gaben kritisches Feedback, halfen bei der Gestaltung der Forschung und überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit Anne-Laure M. Le Ny.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Alonzo, LF, Jain, P., Hinkley, T. et al. Schneller, empfindlicher und kostengünstiger Nachweis von Escherichia coli-Bakterien in kontaminierten Wasserproben mithilfe eines phagenbasierten Assays. Sci Rep 12, 7741 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11468-2

Zitat herunterladen

Eingegangen: 13. Dezember 2021

Angenommen: 18. April 2022

Veröffentlicht: 11. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11468-2

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.