Metagenomsequenzierung und 768 mikrobielle Genome aus kaltem Sickerwasser im Südchinesischen Meer

Scientific Data Band 9, Artikelnummer: 480 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Mikrobengemeinschaften in kalten Sickerstellen sind faszinierende Ökosysteme auf der Erde, die einzigartige Modelle für das Verständnis der Lebensstrategien in unterschiedlichen Tiefseeumgebungen bieten. In dieser Studie wurden 23 Metagenome aus Proben generiert, die im kalten Sickerfeld Site-F im Südchinesischen Meer gesammelt wurden, einschließlich des Meerwassers dicht über den Wirbellosengemeinschaften, der kalten Sickerflüssigkeiten, der Flüssigkeiten unter den Wirbellosengemeinschaften und der Sedimentsäule um sie herum die Sickeröffnung. Durch Binning-Tools haben wir insgesamt 768 Metagenom-assemblierte Genome (MAGs) abgerufen, die schätzungsweise zu >60 % vollständig sind. Schätzungen zufolge waren 61 der MAGs zu >90 % abgeschlossen, weitere 105 waren zu >80 % abgeschlossen. Die phylogenomische Analyse ergab 597 bakterielle und 171 archaeale MAGs, von denen fast alle entfernt mit bekannten kultivierten Isolaten verwandt waren. In den 768 MAGs gehörten zu den häufig vorkommenden Bakterien auf Stammebene Proteobacteria, Desulfobacterota, Bacteroidota, Patescibacteria und Chloroflexota, während zu den häufig vorkommenden Archaea Asgardarchaeota, Thermoplasmatota und Thermoproteota gehörten. Diese Ergebnisse liefern einen Datensatz, der für die weitere Untersuchung der mikrobiellen Ökologie der Tiefsee verfügbar ist.

Messungen)

Metagenom zusammengesetzte Genome

Technologietyp(en)

Metagenomsequenzierung und Genom-Binning

Probenmerkmal – Organismus

Mikroorganismus

Probeneigenschaft – Umgebung

Meereskaltes Sickerbiom

Probenmerkmal – Standort

Südchinesisches Meer

Kalte Sickerstellen sind Meeresbodenmanifestationen der Migration methanreicher Flüssigkeiten aus dem Sedimentuntergrund und unterstützen einzigartige Gemeinschaften über chemosynthetische Wechselwirkungen1. Die in kalten Sickerstellen lebenden Mikroorganismen wandeln die chemische Energie des Methans in Produkte um, die reiche benthische Gemeinschaften rund um die Gaslecks aufrechterhalten2. Der Einsatz von Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation hat die Erkenntnisse über Sickermikrobiome enorm verbessert und wird die mikrobielle Ökologie vom Diversitätsmuster der mikrobiellen Verteilung bis hin zur adaptiven Überlebensstrategie in Tiefseeumgebungen vorantreiben.

Der Kaltaustritt in Standort F (auch bekannt als Formosa Ridge) ist einer der aktiven Kaltaustritte am Nordosthang des Südchinesischen Meeres (SCS)3, wo das Erdgashydrat am Meeresboden freigelegt und von Chemosynthese bedeckt war Gemeinschaften, die hauptsächlich aus Tiefseemuscheln und Galatheidenkrabben bestehen4. Die geochemischen Eigenschaften wurden durch die In-situ-Detektion mit dem entwickelten Raman Insertion Probe (RiP)-System und integrierten Sensoren veranschaulicht5,6,7. Die horizontalen und vertikalen Schwankungen der Methankonzentrationen zeigten gegensätzliche Trends in Feldern vom Zentrum blühender Gemeinden bis zum Sedimentrand6. In den kalten Sickerflüssigkeiten wurden keine CH4- oder H2S-Raman-Peaks festgestellt, während in den Flüssigkeiten unter den üppigen chemosynthetischen Gemeinschaften gelöstes CH4 identifiziert wurde und die in der Nähe der kalten Sickerflüssigkeit gesammelten Sedimentporenwasserprofile durch den Verlust von SO42− und einen erhöhten CH4-Gehalt gekennzeichnet waren , H2S- und HS−-Peaks5,7. Da die mikrobiellen Gemeinschaften in kalten Tiefsee-Seeps häufig durch geochemische Komponenten in Sickerlösungen geprägt werden, haben wir 2017 Proben aus dem kalten Sickerfeld an Standort F gesammelt, darunter das Meerwasser dicht über den Wirbellosengemeinschaften, die kalten Sickerflüssigkeiten usw Flüssigkeiten unter den Wirbellosengemeinschaften und der Sedimentsäule um die Sickeröffnung (Abb. 1 und Tabelle 1). Die Metagenome wurden mit der Illumina HiSeq X Ten-Plattform sequenziert, wobei jedes Metagenom etwa 52,7 Gbit/s bis 80,6 Gbit/s an sauberen Basen lieferte (Tabelle 2). Wir haben außerdem 768 metagenomassemblierte Genome (MAGs) von Umweltbakterien und Archaeen erhalten, die schätzungsweise >60 % vollständig und <20 % kontaminiert sind (Ergänzungstabelle 1). Schätzungen zufolge waren 61 der MAGs zu >90 % abgeschlossen, weitere 105 waren zu >80 % abgeschlossen. Es gab 59 hochwertige MAGs (Vollständigkeit > 90 % und Kontamination < 5 %), was 7,68 % der Gesamtzahl ausmachte. Die anaeroben methanotrophen Archaeen (ANME), die aeroben methanotrophen Bakterien Methylococcales, die sulfatreduzierenden Desulfobacterales sowie die sulfidoxidierenden Campylobacterales und Thiotrichales (Ergänzungstabelle 2) stimmen hinsichtlich der Substratversorgung gut mit den günstigsten mikrobiellen Metabolismen an Methansickern überein. Unterdessen legt die phylogenomische Analyse nahe, dass dieser Satz von Entwurfsgenomen sehr gesuchte Genome umfasst, denen es an kultivierten Vertretern mangelt, wie etwa die Archaeen Bathyarchaeota (30), Aenigmarchaeota (29), Heimdallarchaeota (20) und Pacearchaeota (10) sowie die Bakterien Patescibacteria ( 44), WOR-3 (23), Zixibacteria (13), Marinisomatota (12) und Eisenbacteria (6) et al. (Abb. 2). Darüber hinaus gibt es auch einige potenzielle neue Stämme, darunter NPL-UPA2 (7), UBP15 (4), FCPU426 (2) und SM23–31 (2) et al. Alle hier beschriebenen nicht-redundanten Entwürfe metagenomassemblierter Genome wurden im National Center for Biotechnology Information (NCBI) hinterlegt. Diese Daten werden hoffentlich eine Ressource für nachgelagerte Analysen darstellen, die als Referenz für groß angelegte vergleichende Genomik innerhalb weltweit wichtiger phylogenetischer Gruppen dienen und die Erforschung neuartiger mikrobieller Metabolismen ermöglichen.

Prozess der Probensammlung und Datenanalyse. (a) Standort und Probenahmegebiet im Kaltsickerfeld im nördlichen Südchinesischen Meer. (b) Schematischer Überblick über die in dieser Studie durchgeführte Probenahme und metagenomische Analyse. Jedes Rechteck symbolisiert Prozesse, die Beschreibungen (in Fettdruck), Methoden oder Werkzeuge enthalten, die in der entsprechenden Analyse verwendet werden.

Phylogenetische Vielfalt von 768 metagenomassemblierten Genomen (MAGs) aus kaltem Sickerwasser im Südchinesischen Meer (Ergänzungstabelle 2) und Referenzgenomen von Bakterien und Archaeen, verfügbar in RefSeq (Ergänzungstabelle 3). Der Maßstabsbalken entspricht 3,00 Substitutionen pro Aminosäureposition. Die Anzahl der Entwurfsgenome in jedem Knoten wird angegeben. Die Zweige mit roten Punkten haben keine kultivierten Vertreter.

Während der Kreuzfahrt im September 2017 wurden vom Forschungsschiff KEXUE Proben aus einem kalten Sickerfeld im nördlichen SCS entnommen (Abb. 1 a und Tabelle 1). Das Wasser dicht über den Wirbellosengemeinschaften wurde während der Tauchgänge 164 und 165 mit einem In-situ-Wasserprobenahmezylinder gesammelt, der auf dem ferngesteuerten FAXIAN-Fahrzeug (ROV) ausgestattet war (Proben-ID: SW_1 bzw. SW_2). Die kalte Sickerflüssigkeit wurde während des Tauchgangs 166 an den Gasfahnen gesammelt (Proben-ID: SW_3), und die Flüssigkeit unter den Wirbellosengemeinschaften wurde während des Tauchgangs 167 gesammelt (Proben-ID: SW_4). Etwa 15 l Wasser jeder Probe wurden durch eine 0,22 μm Polycarbonatmembran (Millipore, Bedford, MA, USA) gefiltert. Die Membranen wurden bei –80 °C gelagert und zur DNA-Extraktion verwendet. Während Tauchgang 157 wurde mit einem ROV ein Sedimentkern in einem Bereich mit reduktiven Sedimenten in der Nähe der Wirbellosengemeinschaften gesammelt. Eine dünne Außenschicht (< 1 cm) des Schubkerns wurde verworfen, um eine Kontamination zu vermeiden. Der schwarze, reduzierte Sedimentkern mit einer Länge von 20 cm wurde mit einer Pushcore-Ausrüstung alle zwei Zentimeter in Schichten geschnitten (Proben-ID: RS_1 ~ RS_10). Ein weiterer Sedimentkern wurde an derselben Stelle mit einem leichten, überwachbaren und steuerbaren Tiefsee-Langkernsystem8 gesammelt, und die Probenschichten von 0 bis 300 cm unter dem Meeresboden (cmbsf) wurden aus dem Sedimentkern gesammelt und in 35 cm große Stücke geschnitten. cm-Unterproben (Proben-ID: RS_11 ~ RS_19). Alle Teilproben wurden bis zur DNA-Extraktion bei –80 ° C gelagert. Umweltdaten (CH4, H2S und SO42−) wurden im vorherigen Bericht in situ mit einem Tiefsee-Laser-Raman-Spektrometer erfasst, das mit dem ROV montiert war5,9.

Eine schematische Übersicht über den Arbeitsablauf in dieser Studie ist in Abb. 1b dargestellt. Die genomische DNA aus 2,5 g jeder Sedimentunterprobe wurde mit dem PowerSoil DNA Isolation Kit (QIAGEN) extrahiert. Die genomische DNA aus den 0,22 μm-Filtern wurde mit dem PowerWater DNA Isolation Kit (QIAGEN) extrahiert. Die DNA wurde durch Gelelektrophorese untersucht und die DNA-Konzentration wurde mit dem Qubit® dsDNA Assay Kit im Qubit® 2.0 Flurometer (Life Technologies, CA, USA) gemessen. Der OD-Wert liegt zwischen 1,8 und 2,0, DNA-Gehalte über 0,4 μg werden zum Aufbau der Bibliothek verwendet (Tabelle 2).

Die metagenomische Sequenzierung wurde im Novogene (Tianjin, China) unter Verwendung der Illumina 2 × 150 PE-Protokolle auf einer Illumina HiSeq X Ten-Plattform durchgeführt. Die Vorverarbeitung der von der Sequenzierungsplattform erhaltenen Rohdaten mit Readfq v8 (https://github.com/cjfields/readfq) wurde durchgeführt, um die sauberen Daten für die anschließende Analyse zu erfassen. Saubere Daten aller 23 Proben sind bei NCBI Genbank (SRA) unter den Zugangsnummern SRR13892585~SRR13892607 (Tabelle 2) und unter der BioProject-Zugangsnummer PRJNA707313 verfügbar.

Die erste De-novo-Montage wurde mit MEGAHIT v1.1.3 mit Standardparametern10 durchgeführt. Kurze genomische Assemblies (< 1.000 bp), die die nachfolgende Analyse hätten beeinflussen können, wurden zunächst ausgeschlossen. Die Genome wurden dann basierend auf ihrer Tetranukleotidhäufigkeit, der unterschiedlichen Abdeckung und dem GC-Gehalt sowie der Codon-Verwendung unter Verwendung verschiedener Binning-Tools, einschließlich MetaBAT 2, MaxBin 2.0 und CONCOCT, implementiert durch die MetaWRAP v1.2.1-Pipeline (Standardparameter) (Ergänzungstabelle), gruppiert 1)11,12,13. Die Binning-Ergebnisse wurden mit dem MetaWRAP-Paket (Parameter: -c 60 -x 20)14 verfeinert und alle erzeugten Bin-Sets wurden mit dRep v2.3.2 (Parameter: -comp 60) bei 95 % durchschnittlicher Nukleotididentität (ANI) aggregiert und derepliziert -con 20 -sa 0,9)15. Die taxonomische Klassifizierung jedes Bins wurde durch CheckM v1.0.3 und GTDB-Tk mit Standardparametern (Ergänzungstabelle 2)16,17 bestimmt. Die Bewertung der Behälterqualität (Vollständigkeit > 60 % und Kontamination < 20 %) verschiedener Behälter wurde dann von CheckM v1.0.3 (Parameter: lineage_wf)17 durchgeführt. Als nächstes wurden die ausgewählten Bins für jede Probe mithilfe von MetaSPAdes, die über die MetaWRAP-Pipeline implementiert wurden, wieder zusammengesetzt14,18. Die kodierenden Regionen der endgültigen MAGs wurden mit Prodigal v2.6.3 (Metagenommodus -p meta)19 vorhergesagt. Alle vorhergesagten Gene wurden mit Diamond Blastp (Parameter: -e 1e-5–id 40)20,21 anhand der nr-Datenbank und der KEGG-Prokaryotendatenbank durchsucht. Daten aller MAGs sind bei NCBI Assembly unter den Zugangsnummern JAGLBO000000000~ JAGMFB000000000 verfügbar (Ergänzungstabelle 1).

Die 768 Entwurfsgenome und die 208 Referenzgenomsequenzen, auf die über die NCBI GenBank zugegriffen wurde (Ergänzungstabelle 3), wurden kombiniert, um Orthologe für die phylogenetische Analyse durch Orthofinder (Standardparameter) zu finden22. Jedes Ortholog wurde mit MUSCLE v.3.8.31 (Parameter: –maxiters 16)23 ausgerichtet, mit trimAL v.1.2rev59 (Parameter: -automated1)24 getrimmt und manuell bewertet. Der Genbaum jedes Orthologs wurde mit FastTree v2.1.9 erstellt (Parameter: -gamma -lg;)25. Der endgültige Artenbaum wurde auf der Grundlage von 40.080 Genbäumen mit STAG v1.0.0 (https://github.com/davidemms/STAG) abgeleitet und mit FigTree v1.4.3 (http://tree.bio.ed) angezeigt und kommentiert. ac.uk/software/figtree/) (Abb. 2).

Dieses Projekt wurde bei DDBJ/ENA/GenBank unter der BioProject-Zugangsnummer hinterlegt. PRJNA707313, mit dem Sequence Read Archive hinterlegt unter den Akzessionen SRR13892585~SRR1389260726,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44 ,45,46,47,48. Weitere Daten sind über figshare49 verfügbar, einschließlich der Fasta-Dateien mit den Contigs aller 768 MAG, dem Newick-Format des phylogenetischen Baums.

Eine mögliche Kontamination der Proben wurde durch die Befolgung der Richtlinien für die Analyse von Mikrobiota-Gemeinschaften begrenzt50,51. Kurz gesagt, die Proben wurden in einer sterilen Station im Labor des Forschungsschiffs KEXUE vorbehandelt. Die DNA-Extraktionen fanden in einem speziellen Laborraum unter einer Laminar-Flow-Haube unter Verwendung aseptischer Techniken (wie Oberflächensterilisation, DNA-OFF, Verwendung von sterilem Kunststoffgeschirr und Verwendung von Pipettenspitzen mit Aerosolbarriere) statt. Die Probenverarbeitung wurde innerhalb von 2 Tagen abgeschlossen, wobei für alle Sedimentproben dieselbe Charge des PowerSoil DNA Isolation Kit und für alle Wasserfilterproben das gleiche PowerWater DNA Isolation Kit verwendet wurde. Die gefilterten und gekürzten Illumina-Reads wurden auf ihre Sequenzierungsqualitäten unter Verwendung von fastp v0.20.1 (https://github.com/OpenGene/fastp) mit Standardparametern52 ausgewertet. In allen Proben wurde der Q-Score für die Reads jeder Probe berechnet und zeigte, dass mehr als 90 % der Reads Q30 erreichten (Tabelle 2), was darauf hindeutet, dass die meisten Reads mit niedrigen Fehlerraten erstellt wurden. Metagenomdaten wurden mithilfe der im Manuskript beschriebenen automatisierten Qualitätskontrollschritte und Zusammenstellungsverfahren zusammengestellt und zu MAGs verfeinert. Um die Montagequalität der Contigs sicherzustellen, wurden in den Montageverfahren von MEGAHIT mehrere Kilometer (21,29,39,59,79,99,119,141) ausgewählt. Für das Binning wurden strengere Standards gewählt und die Reihenfolge nach dem Binning neu zusammengestellt, um das beste Ergebnis zu gewährleisten.

Die oben genannten Methoden geben die für die Analyse in den relevanten Abschnitten verwendeten Programme an. Der zur Analyse einzelner Datenpakete verwendete Code ist unter https://github.com/zhcosa/MAGs-from-cold-seep hinterlegt.

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Wir danken dem Forschungsschiff KEXUE der National Major Science and Technology Infrastructure der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (CAS) und Canter for Ocean Mega-Science, CAS, für ihre Unterstützung. Unser besonderer Dank gilt den Piloten und der Besatzung von FAXIAN ROV. Wir danken auch allen Labormitgliedern für ihre technischen Ratschläge und hilfreichen Diskussionen. Diese Arbeit wurde vom Marine S&T Fund der Provinz Shandong für Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao) (2022QNLM030004-3), der National Natural Science Foundation of China (42030407 und 42076091) und dem Senior User Project von RV finanziert KEXUE (KEXUE2021GH01 und KEXUE2019GZ06).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Huan Zhang, Minxiao Wang.

Zentrum für Tiefseeforschung und CAS-Schlüssellabor für Meeresökologie und Umweltwissenschaften, Institut für Ozeanologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Qingdao, 266071, China

Huan Zhang, Minxiao Wang, Hao Wang, Hao Chen, Lei Cao, Zhaoshan Zhong, Chao Lian, Li Zhou und Chaolun Li

Zentrum für Ozean-Megawissenschaften, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Qingdao, 266071, China

Huan Zhang, Minxiao Wang, Hao Wang, Hao Chen, Lei Cao, Zhaoshan Zhong, Chao Lian, Li Zhou und Chaolun Li

Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Peking, 100049, China

Chaolun Li

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MW, HZ und CL haben die Studie entworfen. MW, HZ, HC, LC, CL und ZZ sammelten die Proben. MW, HZ, HC, HW und LZ führten die Analyse durch. HZ und MW haben die Arbeit geschrieben und die Abbildungen und Tabellen vorbereitet. Alle Co-Autoren kommentierten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Chaolun Li.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, H., Wang, M., Wang, H. et al. Metagenomsequenzierung und 768 mikrobielle Genome aus kaltem Sickerwasser im Südchinesischen Meer. Sci Data 9, 480 (2022). https://doi.org/10.1038/s41597-022-01586-x

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Eingegangen: 14. April 2022

Angenommen: 21. Juli 2022

Veröffentlicht: 06. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41597-022-01586-x

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Wissenschaftliche Daten (2023)

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