Intrazytoplasmatische Membranen entwickeln sich in Geobacter Sulfurreducens unter thermodynamisch limitierten Bedingungen

npj Biofilms and Microbiomes Band 9, Artikelnummer: 18 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Geobacter Sulfurreducens ist ein elektroaktives Bakterium, das in der Lage ist, Metalloxide in der Umgebung und in Elektroden in technischen Systemen zu reduzieren1,2. Geobacter sp. sind die Schlüsselorganismen in elektrogenen Biofilmen, da ihre Atmung Fermentationsprodukte anderer Organismen verbraucht und einen terminalen Elektronenakzeptor, z. B. Eisenoxid oder eine Elektrode, reduziert. Um extrazelluläre Elektronenakzeptoren mit einem breiten Spektrum an Redoxpotentialen zu atmen, verfügt G. Sulfurreducens über ein komplexes Netzwerk von Atmungsproteinen, von denen viele membrangebunden sind3,4,5. Wir haben Strukturen der intrazytoplasmatischen Membran (ICM) in G. Sulfurreducens identifiziert. Bei dieser ICM handelt es sich um eine Einstülpung der inneren Membran, die sich durch einen unbekannten Mechanismus gefaltet und organisiert hat und sich häufig, aber nicht immer, in der Nähe der Zellspitze befindet. Mithilfe der konfokalen Mikroskopie können wir feststellen, dass mindestens die Hälfte der Zellen ein ICM enthalten, wenn sie auf Anodenoberflächen mit niedrigem Potenzial gezüchtet werden, wohingegen Zellen, die auf Anodenoberflächen mit höherem Potenzial oder unter Verwendung von Fumarat als Elektronenakzeptor gezüchtet werden, eine deutlich niedrigere ICM-Frequenz aufwiesen. Aus Kryo-Elektronentomogrammen entwickelte 3D-Modelle zeigen, dass die ICM eine kontinuierliche Erweiterung der inneren Membran in Kontakt mit dem zytoplasmatischen und periplasmatischen Raum ist. Die unterschiedliche Häufigkeit von ICM in Zellen, die unter unterschiedlichen thermodynamischen Bedingungen gezüchtet wurden, stützt die Hypothese, dass es sich um eine Anpassung an die begrenzte Energieverfügbarkeit handelt, da eine Zunahme membrangebundener Atmungsproteine den Elektronenfluss erhöhen könnte. Somit bietet das ICM zusätzliche Innenmembranoberfläche, um die Häufigkeit dieser Proteine zu erhöhen. G. Sulfurreducens ist das erste Thermodesulfobacterium oder Metalloxid-Reduktionsmittel, von dem festgestellt wurde, dass es ICMs produziert.

Während wir Prokaryoten klassischerweise durch eine unterschiedliche Organellenkompartimentierung des Zytoplasmas von Eukaryoten unterscheiden, ist die Realität komplizierter. Prokaryoten mit einer Vielzahl von Stoffwechselvorgängen und ökologischen Nischen exprimieren verschiedene wohldefinierte intrazelluläre Organellen6,7,8. Die meisten der in Prokaryoten charakterisierten Organellen fallen in eine von zwei Kategorien. Die ersten sind isolierte Kompartimente, in denen spezielle Bedingungen aufrechterhalten werden, um chemische Prozesse durchzuführen, die im zytoplasmatischen Raum nicht möglich sind, z. B. das Anammoxosom9, das Carboxysom10 und das Acidocalcisom11. Die zweite Kategorie prokaryotischer Organellen besteht aus dicht gepackten Membranstrukturen, die einen höheren Durchsatz für membranabhängige Stoffwechselprozesse ermöglichen, indem sie die verfügbare Oberfläche in einer Zelle vergrößern, z. B. das Thylakoid, das Chlorosom12 und membranöse Strukturen in Methan-, Nitrit- und Ammoniak-Oxidationsmitteln13. 14,15,16. Wir verwenden den allgemeinen Begriff „intrazytoplasmatische Membran“ (ICM), um alle diese Lipidstrukturen in Prokaryoten zu beschreiben, da er Organellen mit Membranstrukturen mit unbekannten Funktionen umfasst. Bei Organismen, die mit geringen thermodynamischen Grenzen arbeiten oder langsame chemische Reaktionen durchführen, sollte die Rate der Enzymaktivität, z. B. die ATP-Produktion, proportional zur für diese Enzyme verfügbaren Membranoberfläche sein. In einigen methanoxidierenden Bakterien wurden beispielsweise zwei essentielle Stoffwechselenzyme – Methanmonooxygenase und Methanoldehydrogenase – im ICM gefunden, die hypothetisch einen höheren Durchsatz für eine potenziell geschwindigkeitsbestimmende Reaktion liefern14,17, und das Gleiche wurde bei Ammoniak beobachtet Monooxygenase in Ammoniak oxidierenden Bakterien15. Interessanterweise geht die Beziehung zwischen Membranproteinen und ICMs in beide Richtungen, da die Modifizierung eines Bakteriums zur Überexpression eines membrangebundenen Enzyms ICM-ähnliche Strukturen in einem Bakterium anregen kann, dem normalerweise jegliche Organellen fehlen18,19.

Geobacter Sulfurreducens ist ein gramnegatives Thermodesulfobakterium (früher als δ-Proteobakterium klassifiziert), das Eisen und andere Metalle in anaeroben Umgebungen reduziert1. Als Organismus, der in der Natur an die Atmung unlöslicher Metalloxide angepasst ist, ist G. Sulfurreducens auch in der Lage, künstliche feste Elektronenakzeptoren zu atmen2. In einem technischen System können wir diesen extrazellulären Elektronentransfer (EET) nutzen, um einen messbaren elektrischen Strom zu erzeugen. Die Amplikon-Sequenzierung elektroaktiver Biofilme zeigt typischerweise, dass Geobacter-Arten der am häufigsten vorkommende Organismus sind, unabhängig von der Quelle des Inokulums20. G. Sulfurreducens reduziert Elektronenakzeptoren mit einem weiten Bereich geschätzter Redoxpotentiale21,22 (−0,17 [Goethit] bis +0,98 V vs. SHE [Palladium]) und erzeugt in technischen Systemen eine relativ hohe Stromdichte (bis zu 10 A ∙). m-2)23 und verfügt über ein komplexes Netzwerk von Elektronenträgern5,22,24,25. Um sich anzupassen, wenn sich das Redoxpotential seines Elektronenakzeptors ändert, exprimiert G. Sulfurreducens mindestens drei verschiedene Elektronentransferwege, die jeweils über optimale Wachstumsbedingungen und ein unterschiedliches elektrochemisches Signal verfügen3,5,22,25. Aus diesen Gründen gilt G. Sulfurreducens als elektroaktiver Modellorganismus26.

Metallreduzierende Bakterien wie G. Sulfurreducens können in einer relativ energiebegrenzten Nische agieren. G. Sulfurreducens, das Acetat oxidiert und natürliche Eisen(III)-Mineralien reduziert, kann im Fall von Goethit27 eine Redoxdifferenz von nur 0,12 Volt aufweisen, gegenüber ~1,1 V bei der aeroben Acetatoxidation. In elektroaktiven Biofilmen erfährt G. Sulfurreducens einen Gradienten des Redoxpotentials, da Zellen im äußeren Bereich des Biofilms aufgrund der Impedanz in der Biofilmmatrix ein niedrigeres effektives Potential haben28. Die Fähigkeit von G. Sulfurreducens, sich an wechselnde Redoxbedingungen anzupassen, hängt von einem komplexen Netzwerk von Elektronenträgern ab. Dieser flexible Stoffwechsel ist strikt auf Membranprozesse angewiesen; Die Elektronentransportkette der inneren Membran in G. Sulfurreducens erfordert unterschiedliche Elektronenträgerproteine, abhängig von der der Zelle zur Verfügung stehenden Energiemenge, dh dem Redoxpotential des terminalen Elektronenakzeptors5,22,29,30. Wenn die Energie durch Elektronenakzeptoren mit niedrigem Redoxpotential begrenzt wird, könnte das Wachstum von G. Sulfurreducens sowohl durch eine niedrigere Atmungsrate gemäß der Nernstschen Kinetik28,31 als auch durch eine geringere Ausbeute an ATP-Erzeugung pro atemtem Elektron begrenzt werden. Der Effekt ist ein membranbegrenzter Atemstoffwechsel. Diese Einschränkung führt zu einer verringerten Wachstums- und Atmungsrate für G. Sulfurreducens, das auf Elektronenakzeptoren mit niedrigem Redoxpotential wächst29,32.

In dieser Arbeit haben wir ICM-Strukturen in G. Sulfurreducens entdeckt. Wir verwendeten konfokale Mikroskopie, in Kunststoff eingebettete Dünnschnitt-Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und kryogene Elektronentomographie (CryoET), um ICM-Strukturen in G. Sulfurreducens zu identifizieren, die in bestimmten subzellulären Regionen lokalisiert sind. Durch die Beobachtung von Zellen unter unterschiedlichen Redoxbedingungen können wir die Hypothese testen, dass ICM in G. Sulfurreducens mit thermodynamischen Bedingungen zusammenhängt, bei denen Zellen bei niedrigem Potential atmen müssen. Diese Beobachtungen haben erhebliche Auswirkungen auf das ganzheitliche Verständnis der Atmung unter energielimitierten Bedingungen.

In dünnen Kunststoffschnitten, die durch Gefriersubstitution tauchgefrorener Zellen hergestellt wurden, beobachteten wir ICM-Strukturen in G. Sulfurreducens-Zellen, die aus einem Biofilm stammten, der auf einer Anode bei -0,07 V vs. SHE gewachsen war. Die ICMs erscheinen meist als parallele Membranbänder im Zytoplasma und sind auf einen Bruchteil des gesamten Zellvolumens lokalisiert (Abb. 1). In einigen Fällen wurden die ICMs auch als gekrümmte oder kreisförmige Strukturen beobachtet. In den meisten Fällen, wenn der TEM-Schnitt die gesamte Länge der Zelle zeigte, traten ICMs meist in Richtung einer der Zellspitzen auf (Abb. 1b, d). Wir fanden keine Zellen mit ICM in mehr als einem Bereich des Zytoplasmas und nicht jede Zelle in unseren Plastikschnitten wies Hinweise auf die Struktur auf. Wir wiederholten das Plastikschnittverfahren mit Zellen, die unter Verwendung von Fumarat, einem löslichen Elektronenakzeptor mit einem höheren Redoxpotential (E'0 = 0,03 V vs. SHE), gezüchtet wurden, und fanden in den resultierenden mikroskopischen Aufnahmen keine Hinweise auf ICM (ergänzende Abbildung 1). .

Tauchgefrorene, gefriersubstituierte, in Kunststoff eingebettete TEM-Aufnahmen von G. Sulfurreducens, gesammelt aus einem Anodenbiofilm, der bei –0,07 V vs. SHE liegt. ICM-Strukturen liegen als parallele Bänder in einem Bereich einer Zelle vor. a, c und e zeigen ICM in Zellen, die senkrecht zur Hauptachse geschnitten sind, während b, d und f ICM in Zellen zeigen, die parallel zur Hauptachse geschnitten sind, wobei sich das ICM nahe der Zellspitze befindet. Die mikroskopischen Aufnahmen wurden mit einem FEI TF20 gemacht. Maßstabsbalken: 100 nm.

Konventionelle in Kunststoff eingebettete TEM wird seit über 50 Jahren zur Charakterisierung bakterieller ICMs eingesetzt33. Die ICM von G. Sulfurreducens teilt einige morphologische Merkmale mit zuvor beschriebenen Strukturen in anderen Bakterien. Ammoniakoxidierende Bakterien (AOB) können ICMs mit einer durchgehenden Membran produzieren, die eng in parallele Bänder gefaltet ist und sich auf einen bestimmten Bereich der Zelle beschränkt, obwohl die ICM in AOB im Vergleich zu dem, was wir in G beobachtet haben, offenbar einen größeren Teil des Zellvolumens einnimmt. Schwefelreduziert33. Das ICM bei AOB entsteht durch Einstülpung der inneren Membran33. In der AOB Nitrosomonas eutropha wird die ICM-Entwicklung durch ammoniakoxidierende Bedingungen stimuliert, ICM wird jedoch während der anoxischen Denitrifikation nicht entwickelt34. In ähnlicher Weise beobachteten wir die Produktion von ICM in G. Sulfurreducens als Reaktion auf bestimmte Redoxbedingungen in der Umwelt. Bei G. Sulfurreducens haben wir den Signalmechanismus, der die ICM-Expression aktiviert, noch nicht bestimmt und auch nicht festgestellt, ob an ihrer Organisation zytoskelettähnliche Proteine beteiligt sind.

Unter Verwendung von CryoET ganzer Zellen beobachteten wir ICM ohne die Artefakte und Membranschäden, die üblicherweise durch Dehydrierung verursacht werden35. Wir haben G. Sulfurreducens direkt auf TEM-Gittern gezüchtet, wobei das Gitter selbst als Anode in einer elektrochemischen Zelle diente, gefolgt von einer sofortigen Vitrifizierung. Rekonstruktionen von G. Sulfurreducens-Zellen zeigen ICM, die nicht so dicht gepackt und regelmäßig sind wie das, was wir bei der TEM mit Kunststoffschnitten beobachtet haben (Abb. 2, 3). Der Unterschied im ICM-Erscheinungsbild zwischen KryoET und in Kunststoff eingebettetem Dünnschnitt-TEM könnte auf Artefakte aus dem Dehydrierungsprozess vor dem Einbetten oder auf einen Unterschied im Wachstumsstadium des Biofilms zurückzuführen sein. CryoET ergab, dass die ICM in G. Sulfurreducens erhebliche Unterschiede in der Morphologie aufweist. In einigen Zellen ist das ICM eine locker organisierte Ansammlung von Membranstrukturen (Abb. 3), in anderen ist es jedoch regelmäßiger und besteht aus kleineren Einheiten (Abb. 2). Diese Varianz kann unterschiedliche Entwicklungsstadien der Struktur darstellen, da Kryotomographieproben erst 24 Stunden nach Einführung eines EM-Gitters in die elektrochemische Zelle entnommen wurden, während TEM-Bilder von Kunststoffschnitten Zellen erfassen, die aus einem vollständig entwickelten Biofilm entnommen wurden. ICMs, wie sie in Kryotomogrammen beobachtet wurden, waren in den meisten Fällen eng mit der inneren Membran verbunden und typischerweise in der Nähe der Zellspitze (Abb. 2).

a Tomogrammschnitte, die veranschaulichen, wie 3D-Modelle durch Tomogrammsegmentierung von ICM erstellt wurden, das sich in der Spitze einer G. Sulfurreducens-Zelle befindet, wobei die Innenmembran, die Außenmembran, das ICM und mehrere Nanodrähte aus dem Tomogramm modelliert wurden. Der Maßstabsbalken beträgt 100 nm. b–d 3D-Modelle von drei separaten Zellen, die ICM nahe der Spitze jeder Zelle anzeigen. Diese Zellen wurden bei –0,07 V vs. SHE direkt auf einem Gitter gezüchtet.

Kryotomograph-Schnitte und 3D-Modell einer G. Sulfurreducens-Zelle, die 24 Stunden lang bei –0,17 V vs. SHE auf einem löchrigen Kohlenstoff/Gold-Kryo-EM-Gitter als Anode gezüchtet wurde. Das Kryotomogramm zeigt, wie sich ICM durch Einstülpung der inneren Membran zu bilden scheint. Oben – ausgewählte Tomogrammschnitte auf der Z-Achse, die Abschnitte der Invagination darstellen. Unten – 3D-Modell der inneren Membran und der äußeren Membran durch (unten links) die gesamte Dicke des modellierten Volumens und (unten rechts) das Modell, das ungefähr in der Z-Achse halbiert ist, um das ICM-Profil in einer anderen Tiefe anzuzeigen. Maßstabsleiste: 100 nm.

Protein-Nanodrähte sind wichtig für die Atmung von G. Sulfurreducens36,37. Wir haben in den meisten der von uns gesammelten Kryotomogramme extrazelluläre Protein-Nanodrähte beobachtet, es ist jedoch unklar, ob ein direkter Zusammenhang zwischen Nanodrähten und ICMs besteht (Abb. 2, Zusatzvideos 1–5). Einige Nanodrähte kreuzen die äußere Membran in der Nähe der ICM-Positionen, andere jedoch nicht. Da erwartet wird, dass es sich beim ICM um einen Bereich mit hoher Stoffwechselaktivität handelt, könnte die Position von Nanodrähten für den extrazellulären Elektronentransfer bevorzugt in der Nähe dieses Bereichs lokalisiert werden.

In einer Probe, die mit einer Anode mit niedrigerem Potential (–0,17 vs. SHE) gezüchtet wurde, können wir ein mutmaßlich früheres ICM-Entwicklungsstadium beobachten (Abb. 3). Es zeigt sich eindeutig, dass die ICM durch Einstülpung der inneren Membran gebildet wird, was mit der ICM-Bildung bei anderen Bakterien (z. B. Rhodobacter sphaeroides) übereinstimmt38,39. Während ein komplexes ICM-Netzwerk offensichtlich ist, zeigt eine genaue Betrachtung, dass alle Abschnitte mit dem zytoplasmatischen Raum in ihnen verbunden sind. Es handelt sich also um eine kontinuierliche Einstülpung der inneren Membran. Am wichtigsten ist, dass der periplasmatische Raum durchgehend ist und von allen Regionen des ICM einen Weg zur Außenmembran bietet. Dieser kontinuierliche periplasmatische Raum ist für den Metabolismus der extrazellulären Atmung von G. Sulfurreducens von größter Bedeutung, wobei Elektronen von der inneren Membran extrazellulär transportiert werden müssen und dabei periplasmatische Cytochrome passieren 40, 41. Es wurde vorhergesagt, dass G. Sulfurreducens aufgrund seines größeren Lpp-Proteins ein breiteres Periplasma als andere Bakterien hat42. Wir haben den periplasmatischen Abstand von der inneren zur äußeren Membran in Tomogrammen von fünf verschiedenen G. Sulfurreducens-Zellen gemessen und einen periplasmatischen Abstand von ungefähr 40 nm gefunden (95 % CI [38,4,40,2], n = 128 Messungen, ergänzende Abbildung 2). größer als der periplasmatische Abstand von 30–32 nm, der in einer anderen Studie in E. coli gefunden wurde42.

Wir können das Vorhandensein von ICM in G. Sulfurreducens auch mit konfokaler Mikroskopie identifizieren. Eine ähnliche Technik wurde verwendet, um ICM bei Methanotrophen zu identifizieren43. Wir haben konfokale Bilder von fixierten G. Sulfurreducens-Biofilmzellen aufgenommen, die bei unterschiedlichen Anodenpotentialen gezüchtet wurden, oder von Zellsuspensionen, die mit Fumarat als Elektronenakzeptor gezüchtet wurden, und jedes Bild enthielt zahlreiche einzelne Zellen (Ergänzungstabelle 1). Das ICM ist ein lokalisierter heller Bereich innerhalb einer Zelle, wenn er mit Nilrot, einem lipidselektiven Fluoreszenzfarbstoff, angefärbt wird44. Einige Zellen haben ein einzelnes ICM, während andere mehrere unterschiedliche ICM-Regionen haben (Abb. 4b). Im Allgemeinen befinden sich die ICM in der Nähe der Zellspitzen, wir haben jedoch auch ICM an Stellen entlang der gesamten Länge einer Zelle beobachtet. Mithilfe des ImageJ-Plugins MicrobeJ45 können wir Zellgrenzen und die darin enthaltenen lokalen Maxima erkennen, die wir als ICM identifiziert haben. Die ICM-Fläche als Bruchteil der gesamten Zellfläche hatte einen Medianwert von 5,7 % im bei -0,07 V gewachsenen Elektrodenbiofilm und 4,2 % in den Fumaratzellen, es gibt jedoch eine hohe Varianz in der Bruchfläche, wobei einige Zellen über 30 % aufwiesen. der von ICM eingenommenen Fläche (Ergänzende Abbildungen 3,4). Dies ist geringer als die von ICMs in Methanotrophen eingenommene Zellfläche43. Durch die Anwendung einer identischen Bildanalyse (ICM-Zählung) auf Zellen, die unter verschiedenen Bedingungen gesammelt wurden, stellten wir fest, dass eine Änderung des Elektronenakzeptors die Häufigkeit von G. Sulfurreducens-Zellen, die ICM aufweisen, erheblich beeinflusst (Abb. 4a). In Biofilmen, die auf Anoden bei höheren Potentialen gezüchtet wurden, beobachteten wir einen relativ geringeren Anteil an Zellen mit ICM (41 ± 4 % bei -0,03 V vs. SHE vs. 58 ± 8 % bei -0,17 V vs. SHE). Mit Fumarat gezüchtete Zellen hatten die geringste Inzidenz von ICM (14 ± 10 %), obwohl das Redoxpaar Fumarat/Succinat ein Potential von etwa +0,03 gegenüber SHE aufwies, was im Redoxpotential unserem höchsten untersuchten Anodenpotential ähnelte. In einem Biofilm wird es jedoch aufgrund von ohmschen Verlusten und Diffusionsbeschränkungen einen Redoxpotentialgradienten geben23,46,47, daher gehen wir davon aus, dass mit Fumarat gezüchtete Zellen im Durchschnitt ein höheres Redoxpotential erfahren als Anoden-Biofilmzellen auf einer Elektrode bei a ähnliches Potenzial. Da niedrigere Anodenpotentiale weniger potenzielle Energie für das Wachstum bereitstellen25, könnte die höhere Häufigkeit von ICM eine Anpassung an die Energiebegrenzung sein. Unsere Bildanalyse verwendete konservative Parameter zur Identifizierung von ICM innerhalb von Zellen, sodass die absolute Häufigkeit von ICM wahrscheinlich höher ist.

eine Fraktion von Zellen mit einem ICM in G. Sulfurreducens unter verschiedenen Wachstumsbedingungen. Jeder Punkt stellt ein einzigartiges Bild mit durchschnittlich 113 Zellen dar. Rohzahlen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1. Die drei Potentiale – −0,17, −0,07 und +0,07 – stellen Zellen dar, die von Anoden gesammelt wurden, die auf den jeweiligen Potentialen gegenüber SHE standen. Die Zellen im „Fumarat“-Zustand wurden planktonisch mit Fumarat als Elektronenakzeptor gezüchtet. Die statistischen Tests bestanden aus einem zweiseitigen t-Test mit Hochberg-Mehrfachvergleichskorrektur. *(ρ < 0,05), ***(ρ ≤ 0,001), ****(ρ ≤ 0,0001). b Summenprojektion konfokaler Z-Stapel von G. Sulfurreducens-Zellen, die auf einer Elektrode bei -0,07 V vs. SHE gewachsen sind, mit annotierten Beispielen für ICM. c Summenprojektion von Zellen, die mit Fumarat als Elektronenakzeptor gezüchtet wurden, was die typische Zellmorphologie veranschaulicht, wenn kein ICM vorhanden ist. Beide Zellbilder wurden aus größeren Bildern ausgeschnitten, die mit 100-facher Vergrößerung unter Verwendung von Nilrot als Phospholipid-selektivem Fluorophor aufgenommen wurden. Siehe vergrößerte Einschübe in der ergänzenden Abbildung 5.

G. Sulfurreducens verfügt über einen komplexen und effizienten Atmungsstoffwechsel. An der inneren Membran werden Elektronen je nach Redoxpotential des terminalen Elektronenakzeptors in verschiedene Atmungswege aufgeteilt3,5,22. Da es sich um eine Einstülpung der Innenmembran handelt, muss die ICM die für die Atmung wichtigen Cytochrome der Innenmembran enthalten. In Ammoniak- und Methan-oxidierenden Bakterien sind die geschwindigkeitsbestimmenden Atmungsenzyme – Ammoniakmonooxygenase bzw. Methanmonooxygenase – im ICM vorhanden15,17. Für Organismen mit schmalen thermodynamischen Rändern könnte ein ICM eine höhere Atmungsrate ermöglichen, indem die Membranoberfläche und die Gesamtzahl der Atmungsproteine vergrößert werden. Die Herstellung eines ICM muss eine erhebliche Energieinvestition für eine Zelle darstellen, und die strukturelle Organisation des ICM in G. Sulfurreducens lässt auf eine spezielle Funktion außerhalb der Lipidspeicherung schließen. Die Produktion von ICMs erklärt, warum G. Sulfurreducens einen höheren Lipidgehalt aufweist als andere gramnegative Bakterien48, da die Produktion von ICM in anderen Bakterien zu erhöhten Lipidfraktionen führt43,49.

In unserer Studie fanden wir eine höhere Inzidenz von ICM in Zellen, die unter weniger thermodynamisch günstigen Bedingungen wachsen (Abb. 4a), was mit der Verwendung eines ICM zur Erhöhung der Atemfrequenz unter Grenzbedingungen vereinbar ist. Eine respiratorische ICM bei G. Sulfurreducens würde einen Mechanismus erfordern, um Elektronen an den Rest des extrazellulären Elektronentransfernetzwerks weiterzuleiten, und wenn eine offene Verbindung mit dem Periplasma besteht, wie in Abb. 3 dargestellt, könnten Elektronen durch Diffusion periplasmatischer Cytochrome übertragen werden (z. B. PpcA, GSU1996)40,50. Der Transport dieser Cytochrome von den ICMs zur Außenmembran würde jedoch über eine viel größere Distanz als im typischen periplasmatischen Raum erfolgen, da ICMs offenbar die gesamte Zelldicke überspannen und Regionen haben, die bis zu 200 nm von der Außenmembran entfernt sind.

Während G. Sulfurreducens nicht das einzige Bakterium mit einer ICM ist, wurde bei keinem eng verwandten Organismus ein vergleichbares ICM gefunden. Unseres Wissens ist es der erste Organismus aus dem Stamm Thermodesulfobacteriota, der nachweislich ein ICM produziert, der erste Metalloxid-Reduzierer, der dies tut, und die erste Dokumentation von ICMs, die in Biofilmen gebildet werden. Das ICM in G. Sulfurreducens bietet eine gute Gelegenheit, die ICM-Bildung im Allgemeinen zu untersuchen, da wir seine Expression leicht steuern können, indem wir das Redoxpotential des Elektronenakzeptors ändern, und die polare Lokalisierung des ICM in der Spitze eine Möglichkeit bietet, intrazelluläre Untersuchungen durchzuführen Organisation in Bakterien. Die unterschiedliche Produktion von ICMs in G. Sulfurreducens legt nahe, dass diese Struktur auf natürliche Weise gebildet wird, um die Atemfrequenz unter thermodynamisch und kinetisch limitierten Bedingungen zu erhöhen, eine Hypothese, die bereits für andere Mikroorganismen vorgeschlagen wurde8. Im Gegensatz zu anderen Bakterien, die ICMs produzieren, kann G. Sulfurreducens nicht seinen gesamten Atmungsweg innerhalb des ICM absolvieren. Elektronen aus dem ICM in G. Sulfurreducens müssen für die extrazelluläre Atmung zur Außenmembran wandern, und diese Elektronen müssen möglicherweise Mikrometer durch einen Biofilm wandern, bevor sie den terminalen Elektronenakzeptor erreichen

G. Sulfurreducens verfügt über verschiedene Ansätze zur Optimierung der Energieeinsparung unter limitierenden und variierenden Redoxbedingungen. Drei charakterisierte Pfade scheinen gleichzeitig in einem elektrogenen Biofilm zum Ausdruck zu kommen, um die Energieeinsparung zu maximieren51. Die Erzeugung von ICMs unter energielimitierenden Bedingungen scheint ein zusätzliches Instrument zur Maximierung der Energieproduktion innerhalb der Zelle zu sein. Nernstsche Modelle, die zur Vorhersage der Atmungsraten bei G. Sulfurreducens verwendet werden, würden eine langsame Atmungsrate bei niedrigeren Potentialen vorhersagen28,31,52. Die langsamere Atmungsrate ist die Folge eines geschwindigkeitsbestimmenden Elektronentransferproteins, das sich vermutlich an der inneren Membran befindet28 ,53. Wenn G. Sulfurreducens die Menge dieses geschwindigkeitsbestimmenden Proteins durch Erhöhung der Menge der vorhandenen Innenmembran erhöhen kann, wird die scheinbare Einschränkung gemildert und es können höhere Atemfrequenzen erreicht werden. Daher ist es wichtig zu wissen, wie ICMs verwendet werden und unter welchen Bedingungen sie hergestellt werden, um die Geschwindigkeit der elektrischen Stromerzeugung durch G. Sulfurreducens vorherzusagen. Zukünftige ICM-Studien zu G. Sulfurreducens werden wahrscheinlich die genetischen Werkzeuge nutzen, die für den Organismus entwickelt wurden, sowie kreative Bildgebungstechniken.

G. Sulfurreducens PCA (ATCC, Virginia, USA) wurde aus Glycerin-Gefriervorräten unter Verwendung von Fumarat oder einer Elektrode als Elektronenakzeptor gezüchtet25. Fumaratzellen wurden in versiegelten anaeroben Kulturröhrchen mit ATCC 1957-Medium gezüchtet, das 1,5 g NH4Cl, 0,6 g NaH2PO4, 0,1 g KCl, 2,5 g NaHCO3, 0,82 g Natriumacetat, 8 g Natriumfumarat und jeweils 10 ml Wolfe's Vitamin- und Wolfe's Minerallösungen enthielt pro Liter Wasser, das vor dem Verschließen und Autoklavieren mit Gas durchperlt wurde. Unter allen Bedingungen wurde ein Gasgemisch aus 80/20 % N2/CO2 verwendet, um Sauerstoff aus dem Medium zu entfernen und einen pH-Wert nahe 7 aufrechtzuerhalten. Elektrodenzellen wurden unter Verwendung desselben Mediums ohne Fumarat in mikrobiellen elektrochemischen 100-ml-Einkammerzellen auf 6- 8-cm2-Graphitelektroden (Graphitestore, Illinois, USA), eingestellt auf entweder -0,17, -0,07 oder +0,07 V vs. SHE. Der elektrische Strom wurde mit einem VMP3-Potentiostat (BioLogic, Tennessee, USA) überwacht. Die Reaktorflaschen wurden mit Medium gefüllt, bei 121 °C autoklaviert und dann vor der Beimpfung mit Gas durchströmt, um Sauerstoff zu entfernen. Jeder Reaktor hatte eine Ag/AgCl-Referenzelektrode (BASi, Indiana, USA).

G. Sulfurreducens-Zellen aus einem reifen Biofilm (~30 Tage Wachstum) wurden in Phosphatpuffer mit 4 % Paraformaldehyd und 2 % Glutaraldehyd (v/v) fixiert und dann in flüssigem Propan tiefgefroren, bevor sie durch Gefriersubstitution in 2 % Osmiumtetroxid dehydriert wurden in Aceton auf Trockeneis bei -80 °C gelöst. Die Zellen wurden zur Einbettung in Araldite 502-Harz (Ted Pella, Inc.) langsam auf Raumtemperatur gebracht. Diese Schnitte wurden in einer Dicke von 70 nm geschnitten und zur Verbesserung des Kontrasts mit Bleiacetat sekundär angefärbt. Sämtliche Dünnschnittaufnahmen wurden mit einem Tecnai TF-20 (FEI) oder einem Phillips CM12 durchgeführt.

Um Elektroden-Biofilmzellen für KryoET zu züchten, haben wir einen Halter für gefensterte Kohlenstoff-TEM-Gitter entwickelt, der in bioelektrochemische Zellen mit aktiv wachsenden Kulturen eingesetzt werden kann. Die Gitter im Halter werden gegen eine Titanplatte gehalten, die als Anode und Elektronenakzeptor für die Bakterien fungiert. 6 nm BSA-konjugierte Gold-Nanopartikel-Referenzmarken wurden getrocknet und dann bei 60 °C gebacken, um die Gold-Referenzmarken auf den Gittern zu fixieren, bevor sie in den Bioreaktor eingeführt wurden. Die TEM-Gitter im Halter wurden nach 24 Stunden entfernt und sofort in mit flüssigem Stickstoff gekühltem Ethan tauchgefroren, wobei ein eigens entwickelter manueller Tauchfroster verwendet wurde, um die Zellen in ihrem aktiven Zustand einzufangen (ergänzende Abbildungen 6, 7). Für die Fumarat-Bedingung wurde eine Suspension von 7–10 Tage lang gewachsenen Zellen auf jedes Gitter pipettiert, zur Entfernung überschüssiger Flüssigkeit abgetupft und mit dem FEI Vitrobot Mark IV eingefroren.

Die gefrorenen, hydratisierten Zellen wurden auf einem Krios G2 (FEI, Oregon, USA) bei Neigungen von –65° bis +65˚ in 2,0˚-Winkelschritten unter Verwendung eines dosissymmetrischen Sammelschemas54 in Regionen abgebildet, in denen einzelne Zellen über Fenstern in beobachtet werden konnten Kohlenstoff. Die Bilder wurden mit einer nominellen Vergrößerung von 6500x aufgenommen, was einer Pixelgröße von 1,8 Å im Superauflösungsmodus auf der K2-Gipfelkamera mit einer Dosisrate von 0,5 Elektronen pro Å2 * Sekunde für drei Sekunden und einer Bildrate von 0,2 Bildern pro Sekunde (insgesamt) entspricht Dosis von 100 Elektronen pro Å2). Einzelne Filmbilder wurden verstärkungskorrigiert, mit MotionCor255 ausgerichtet und die Gesamtbilder wurden um 2 gruppiert, was zu einem Bild mit einer Skalierung von 3,6 Å/Pixel führte. Die summierten Bilder wurden neu gestapelt und anschließend wurde eine tomografische Rekonstruktion in eTOMO56 durchgeführt. Schnitte aus jedem Tomogramm wurden von IMOD mithilfe der ZAP-Fensterspeicherfunktion ausgegeben, die in der nativen Auflösung des Monitors speichert. Die 3D-Modellierung wurde in IMOD durchgeführt und in ChimeraX57 visualisiert.

Die Anoden-Biofilmzellen von G. Sulfurreducens wurden 12 bis 20 Tage, nachdem der Strom exponentiell zu wachsen begann und mindestens 2 A/m2 betrug, resuspendiert, fixiert und abgebildet. G. Sulfurreducens-Biofilmzellen wurden durch leichtes Vortexen in Phosphatpuffer von der Elektrode entfernt, 5 Minuten lang bei 4000 xg pelletiert, 1 Stunde lang in 4 % Paraformaldehyd resuspendiert, dann gespült und in Phosphatpuffer bei 7 °C gelagert. Unter Fumaratbedingungen gezüchtete lebende G. Sulfurreducens-Zellen wurden 5–7 Tage nach der Inokulation abgebildet. Zellen unter Anoden- und Fumaratbedingungen wurden mit 50 mM Phosphatpuffer zur Lipidfärbung mit Nilrot (ThermoFisher/Invitrogen, rot, Anregung: 561 nm) auf eine Endkonzentration von 2 µg/ml verdünnt. Die Proben wurden mindestens 15 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren gelassen. Die gefärbten Zellen wurden auf einem Standard-Glasobjektträger oder einem mit 2 % Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträger mit einem 1 ½ Deckglas, versiegelt mit Nagellack, abgebildet.

Fluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Nikon C2+-Mikroskop aufgenommen, das mit einem 100X Plan Apo λ (NA 1,45)-Ölobjektiv ausgestattet war, unter Verwendung der angrenzenden NIS Elements-Software, betrieben in einer anaeroben Glovebox. Nilrot wurde mit einem 561-nm-Laser angeregt und mit einem 525/50 561 LP-Filterwürfel gefiltert.

Z-Stapel wurden zu Summenprojektionen verarbeitet und ein Gaußscher Unschärfefilter (σ = 1) zur Glättung in ImageJ angewendet. Das ImageJ MicrobeJ-Plug-in45 wurde für den bakteriellen und ICM-Nachweis von G. Sulfurreducens-Zellen sowohl unter Anoden- als auch unter Fumaratbedingungen verwendet, mit zusammenfassender Ausgabe in Ergänzungstabelle 1 und Analyseparametern in Ergänzungsabbildung 8. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung des Student-t-Tests durchgeführt für Mehrfachvergleiche mit der Benjamini-Hochberg-Methode korrigiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Auf die zur Erstellung der Abbildungen für dieses Manuskript verwendeten Tomogramme kann im EMDB-EBI-Repository unter den Zugangsnummern EMD-27710, EMD-27729, EMD-27748 und EMD-27747 zugegriffen werden.

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Die Finanzierung dieser Arbeit erfolgte durch das Office of Naval Research (ONR-Preis N0014-20-1-2269). Die konfokale Mikroskopie wurde mit einer Nikon C2+ durchgeführt, die durch ein ONR DURIP-Stipendium N00014-19-1-2531 erworben wurde. Die gesamte Elektronenmikroskopie wurde in den Elektronenmikroskopie-Kerneinrichtungen der ASU durchgeführt. Die 3D-Modellmanipulation wurde teilweise mit UCSF ChimeraX durchgeführt, das von der Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics an der University of California, San Francisco, mit Unterstützung der National Institutes of Health R01-GM129325 und des Office of Cyber Infrastructure and Computational Biology entwickelt wurde. Nationales Institut für Allergien und Infektionskrankheiten.

Schule für nachhaltiges Ingenieurwesen und gebaute Umwelt, Arizona State University, Tempe, AZ, USA

Ethan Howley

School for Engineering Mass Transport and Energy, Arizona State University, Tempe, AZ, USA

Anna Mangus & Caesar I. Türme

Eyring Materials Center, Arizona State University, Tempe, AZ, USA

Dewight Williams

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EH plante und führte Experimente durch, erstellte Figuren, verfasste den ersten Entwurf des Manuskripts und redigierte das Manuskript; AM plante und führte die konfokale Mikroskopie durch; DW führte eine Kryotomographie durch; CT sicherte die Finanzierung, plante die Studie und redigierte das Manuskript.

Korrespondenz mit César I. Torres.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Howley, E., Mangus, A., Williams, D. et al. Intrazytoplasmatische Membranen entwickeln sich in Geobacter Sulfurreducens unter thermodynamisch limitierten Bedingungen. npj Biofilms Microbiomes 9, 18 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00384-6

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Eingegangen: 05. Oktober 2022

Angenommen: 17. März 2023

Veröffentlicht: 07. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00384-6

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