Galvanisch abgeschiedene magnetische nanoporöse Membran für hohe

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1358 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Superparamagnetische Nanokügelchen bieten gegenüber Mikrokügelchen mehrere Vorteile für die immunologische Einfangung von Nanoträgern (extrazelluläre Vesikel, Lipoproteine und Viren) in einem Bioassay: hohe Einfangausbeute, kürzere Inkubationszeit und höhere Einfangkapazität. Allerdings lassen sich Nanokügelchen nur schwer „herunterziehen“, da ihre superparamagnetischen Eigenschaften hohe nanoskalige Magnetfeldgradienten erfordern. Hier wird gezeigt, dass eine galvanisch abgeschiedene, spurgeätzte Membran einen einzigartigen superparamagnetischen Nanokantenring mit mehreren Kanten um Nanoporen herum erzeugt. Bei einem gleichmäßigen externen Magnetfeld erzeugen der induzierte Monopol und Dipol dieses Nano-Kantenübergangs zusammen eine 10-mal höhere Nanokügelchen-Einfangkraft. Eine dichte Nanokügelchen-Suspension kann mit hohem Durchsatz und einer Partikeleinfangrate von 99 % durch die magnetische nanoporöse Membran (MNM) gefiltert werden. Die Ausbeute an spezifischen Nanoträgern in heterogenen Medien durch Nanokügelchen/MNM übersteigt 80 %. Reproduzierbarkeit, geringer Verlust und konzentrationsunabhängige Einfangraten werden ebenfalls nachgewiesen. Dieses MNM-Material erweitert somit die Anwendung der Nanokügelchen-Immunerfassung auf physiologische Proben.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) und Lipoproteine sind biologische Nanopartikel, die in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten vorkommen1,2,3. Ihre kürzlich entdeckte Funktion, molekulare Fracht zwischen Zellen zu transportieren, hat in vielen Bereichen zu erheblichen Forschungsaktivitäten geführt4,5. Diese biologischen Nanoträger könnten entscheidende Vermittler der interzellulären Kommunikation sein6,7. Daher sind spezifische Elektrofahrzeuge, Lipoproteine und ihre molekularen Ladungen ebenfalls potenzielle Biomarker für Krankheiten8,9,10. Allerdings kommen diese Biomarker oft nicht nur auf erkrankte Zellen vor, sondern werden einfach überexprimiert. Daher ist eine genaue Quantifizierung erforderlich. Aufgrund ihrer Größe und Heterogenität bleibt die Isolierung spezifischer EVs und Lipoproteine mit hoher Ausbeute eine Herausforderung und kann zu erheblichen Verzerrungen im Biomarker-Assay führen11,12,13,14,15. Elektrofahrzeuge und Lipoproteine neigen außerdem dazu, in vielen Geräten abgebaut, aggregiert oder adsorbiert zu werden16,17. Daher wird die sofortige und kurze Kontaktisolierung gegenüber der Durchflusszytometrie und der chromatographischen Trennung bevorzugt, deren Vorbehandlungs-/Trennprozesse langwierig und komplex sind. Eine wirksame, schnelle und zugängliche Isolierungsmethode ist daher eine Voraussetzung für jede klinische Anwendung von Elektrofahrzeugen und Lipoproteinen. Fortschritte bei Hochausbeute-Einfangtechnologien sind in vielen biomedizinischen Bereichen von Vorteil, unter anderem für den Nachweis pathogener Viren oder Bakterien.

Die spezifischste EV- und Lipoprotein-Isolierungsmethode ist die Immunabscheidung;18,19,20 jedoch weisen herkömmliche Immunabfangtechnologien wie Immunpräzipitation (IP) und Immunaffinitätschromatographie aufgrund von Sondensättigung und Analytverlust Probleme mit geringer Ausbeute auf. Wenn die Nanoträger fluoreszierend markiert sind, können die von magnetischen Mikrokügelchen eingefangenen Nanoträger durch Durchflusszytometrie sortiert und quantifiziert werden. Der Markierungs- und Isolierungsprozess ist jedoch zeitaufwändig und kann mehr als einen Tag dauern, um die optimale Ausbeute zu erreichen, was zu einem erheblichen Nanoträgerverlust führt. Ihr Durchsatz wird auch durch die lange Inkubationszeit (8–48 Stunden) aufgrund der geringen Mobilität der Mikrokügelchen für die transportbegrenzte Andockreaktion begrenzt. Eine Lösung für die Probleme mit der Ausbeute und der Inkubationszeit ist die Verwendung nanomagnetischer Kügelchen. Ihre große Oberfläche pro Volumen bietet mehr Bindungsstellen. Ihre geringere Größe führt zu einer höheren Diffusionsfähigkeit und einer kürzeren Inkubationszeit (~30 Minuten). Die Perlen können auch durch eine heterogene physiologische Probe diffundieren, um spezifische Nanopartikel-Ziele einzufangen, die aufgrund von Komplexierung oder Aggregation eine eingeschränkte Mobilität aufweisen. Ihre große Oberfläche pro Volumen bietet mehr Bindungssonden um einen Faktor, der dem Verhältnis der Mikrokügelchen-/Nanokügelchen-Radien (~100) bei gleicher Kügelchengewichtskonzentration entspricht. Diese Erhöhung der Sondenzahl kann zur vollständigen Erschöpfung aller Ziel-Nanoträger führen, insbesondere wenn die Antikörpersonden eine hohe Affinität aufweisen, wodurch eine um Größenordnungen höhere Nanoträger-Bindungsausbeute erzielt wird.

Aufgrund ihrer superparamagnetischen Natur ist es jedoch schwierig, Nanokügelchen und ihre eingefangenen Nanoträger nach der Massenimmuneinfangung einzufangen. Die magnetische Kraft auf die superparamagnetischen Kügelchen ist proportional zum Quadrat des Feldgradienten (doppeltes Produkt aus Feld und Feldgradient), wohingegen die Kraft auf ein magnetisches Mikrokügelchen proportional zum lokalen Feld ist. Bei den üblicherweise verwendeten magnetischen Mikrokügelchenfallen ist der Feldgradient auf weniger als einen Radius des Mikrokügelchens beschränkt und kann daher Nanokügelchen nur in einem kleinen Bereich um das Mikrokügelchen herum einfangen. Daher ist für eine hohe Ausbeute eine lange Säule aus dicht gepackten Perlen erforderlich. Kommerzielle Mikrokügelchen-Säulen (μColumn, Milyteni Biotec) zum Einfangen von Nanokügelchen fangen beispielsweise nur 20–30 % der Nanokügelchen ein21. Wiederholtes (>4 ×) Einfangen ist erforderlich, um eine Ausbeute von >90 % zu erzielen. Ein Magnetfilm kann aufgrund seiner nicht fokussierenden (nicht radialen) Geometrie eine größere Feldeindringlänge erzeugen als eine Magnetperle. Kürzlich haben Issadore und Kollegen eine mit einer Magnetschicht beschichtete nanoporöse Membran mit verbesserter Einfangausbeute entwickelt, für eine effiziente Perleneinfangung sind jedoch immer noch mehrere Membranschichten erforderlich22. Obwohl das Feld weitreichend ist, entspricht der Feldgradient nicht einem planaren magnetischen Film, außer an den Ecken. In unserer früheren Arbeit zu elektrischen Feldern an Mikrokanälen23 und Nanoporen24 haben wir gezeigt, dass ein singuläres elektrisches Feld mit einem hohen Gradienten auf der Seite mit hoher Permittivität (Wasser) einer Keilecke eines Kanals oder einer Pore auftritt, wenn der Keilwinkel α des Die Phase mit höherer Permittivität überschreitet π. Dieses singuläre Keilfeld fällt radial von der Keilspitze mit einer Potenzgesetzsskalierung von −(π/α) − 1 ab und weist daher auch einen hohen Feldgradienten auf. Der radiale Zerfallsexponent liegt zwischen −2 einer Kugel und −3/2 eines unendlich langen Zylinders. Dieser singuläre Keilmodus ist antisymmetrisch um den Keil und führt einen Dipol in der Phase mit hoher Permittivität ein. Es gibt eine bekanntere „Blitzableiter“-Keilsingularität in der Nahfeldplasmonik25,26,27, die symmetrisch um den Keil herum verläuft, wobei das singuläre Feld auf der Seite der niedrigen Permittivität auftritt. Es tritt auf, wenn die Seite mit hoher Permittivität einen Keilwinkel aufweist, der kleiner als π ist. Es führt einen Monopol auf der Seite des Keils mit niedriger Permittivität ein. Hier erweitern wir dieses Konzept auf Magnetfelder, um eine ertragreiche Erfassung superparamagnetischer Perlen mit hohem Durchsatz zu erreichen. Wir haben eine superparamagnetische NiFe-Nanokante mit mehreren Kanten und einer heterogenen Verbindung entworfen, deren Kanten sowohl einen magnetischen Monopol als auch einen Dipol um jede Nanopore einer nanoporösen Polymermembran herum tragen. Dieser Ansatz wird die Einfangausbeute einer Membran bei einem Durchsatz von 5 ml/h für eine einzelne magnetische nanoporöse Membran (MNM) deutlich auf 99 % steigern.

Im Vergleich zum glatten Porenrand, der beim Sputtern entsteht, sind die Kanten der galvanisierten Membran schärfer und nähern sich der Keilgeometrie an. Daher wurde für die Ni80Fe20-Schichtabscheidung Elektroplattieren anstelle von Sputtern verwendet (Abb. 1a). Darüber hinaus wickelt sich der NiFe-Film aufgrund des hohen Feldes an der Au-Film-Verbindung während des Galvanisierens um die in der Pore gesputterte Goldschicht, um die gewünschte Kantengeometrie für einen Dipol zu bilden. Die nicht eingefangenen EVs können durch die geraden Poren gelangen und im Durchfluss gesammelt werden (Abb. 1b). Wir haben die Effizienz und Spezifität von MNM anhand von High-Density-Lipoproteinen (HDL) als Modell nachgewiesen und festgestellt, dass mit dieser Methode mehr als 80 % des HDL zurückgewonnen werden, was einer nahezu doppelt so hohen Rückgewinnungsrate bei kommerziellen Kits entspricht. Wir haben auch gezeigt, dass MNM eine hohe und konstante Ausbeute aufweist und daher die notwendigen Statistiken zur Quantifizierung von Biomarkern liefern kann, die von EVs und Lipoproteinen in heterogenen physiologischen Flüssigkeiten getragen werden (Abb. 1c).

a Herstellung der magnetischen nanoporösen Membran (MNM). Insgesamt wurden 80 nm Au auf den spurgeätzten PET-Film abgeschieden, um eine gute Haftung und elektrische Leitfähigkeit für die Elektroplattierung zu gewährleisten. Anschließend wurde durch Elektroplattieren ein 200 nm dicker NiFe-Film auf der Membran abgeschieden. Insgesamt wurden schließlich 10 nm Au abgeschieden, um unspezifische Adsorption und chemische Instabilität zu reduzieren. Rechts: Der heterogene Nanokantenübergang am Rand der Nanopore auf der Membran ist hervorgehoben. b MNM-basierter Immunocapture-Aufbau. Zunächst wurden der Antikörper und das Antigen inkubiert, um einen Ab-Ag-Komplex zu bilden, gefolgt von der Inkubation mit magnetischen Nanokügelchen, die mit Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern konjugiert waren. Anschließend wurde die verdünnte Probe mit einer Spritze und einer Pumpe durch die Kammer des MNM-Geräts geleitet. Das MNM-Gerät wurde so zusammengebaut, dass das MNM zwischen zwei 3D-gedruckten Chips eingebettet war. Das Gerät wurde zwischen zwei Magneten montiert, wobei der Magnet in der Nähe des Einlasses eine Ringform hatte. Die Magnetkügelchen wurden, wie hervorgehoben, am Rand der Nanoporen eingefangen. c Experimentelle Schritte der drei Anwendungen. Anti-ApoA1-Antikörper wurden zum Einfangen von HDL verwendet; Zur Isolierung der EVs wurde eine asymmetrische Nanoporenmembran verwendet, wobei eine kleine Menge HDL verblieb, und wir verwendeten MNM, um das restliche HDL zu entfernen und die EV-Fraktion zu reinigen. In der EV-Fraktion wurde MNM verwendet, um das spezifische EV mit einem bestimmten Oberflächenprotein, dh EGFR, einzufangen.

Da das magnetische Moment eines superparamagnetischen Nanokügelchens durch das äußere Feld induziert wird, wird die darauf wirkende Kraft wie folgt beschrieben:

Dabei ist χeff die effektive magnetische Suszeptibilität der Kügelchen, V das Kügelchenvolumen, μ und μ0 das Vakuum und die magnetische Permittivität des Materials und \(\vec{B}\) das Magnetfeld. Die Magnetkraft steigt mit dem Quadrat des Feldgradienten oder dem Doppelten des Feldes multipliziert mit dem Feldgradienten. Daher ist ein hoher Magnetfeldgradient und nicht nur ein hohes Magnetfeld der Schlüssel zur Erzielung einer hohen Perlenrückgewinnung. Solche hohen Gradienten können mit scharfen Geometrien (Keilen und Kegeln) eingeführt werden. Diese geometrische Verstärkung des elektromagnetischen Feldes wurde auf eine Vielzahl technischer Designs angewendet, von Großantennen28,29 bis hin zu Nanostrukturen30,31. Zuvor nutzten wir das singuläre elektrische Feld am Rand von Mikrokanälen23 und Nanoporen24, um Kolloide einzufangen und Moleküle durch Dielektrophorese zu translozieren. Wie in Abb. 2a, c gezeigt, ist der Rand der Nanopore auf der gesputterten Membran glatt. Aufgrund der anisotropen Natur des Sputterns bedeckte die NiFe-Schicht nur die Oberseite der Au-Schicht. Aufgrund der Fokussierung des elektrischen Feldes während des Plattierens trat in der galvanisierten Membran eine schärfere Kante auf (Abb. 2b, d). Der geometrische Unterschied ist auch von der Oberseite der Membranen aus zu beobachten (Abb. 2e, f). Im Vergleich zur gesputterten Membran (Abb. 2e) wird eine feinere Kristallisation der galvanisierten Membran (Abb. 2f) beobachtet, was darauf hindeutet, dass mit der galvanisierten Membran eine schärfere Ecke und ein höherer Feldgradient erreicht werden können. Der NiFe-Film wuchs auch innerhalb der Pore und bildete den heterogenen Keilübergang, da die Galvanisierung im Gegensatz zum Sputtern auch auf der Seite des 80-nm-Goldfilms erfolgt. Unter gleichmäßiger äußerer Magnetisierung bei 0,4 Tesla entwickelt sich in der Wasserphase ein maximales Feld von 0,62 Tesla und ein maximaler Gradient der Flussdichte im Quadrat bei 2,3 × 105 T2/cm (Abb. 2h), verglichen mit 0,48 Tesla und 2,2 × 104 T2/ cm für den gesputterten NiFe-Film ohne Keilring, was einer zehnfachen Vergrößerung des Kraftfeldes von Gl. entspricht. (1).

Schematische Darstellung der Nanoporen auf (a) einer gesputterten magnetischen nanoporösen Membran und (b) einer galvanisch beschichteten magnetischen nanoporösen Membran. Der Rand der Nanopore ist hervorgehoben (die letzte dünne Goldschicht wird ignoriert). c SEM-Querschnittsbilder einer einzelnen Nanopore auf einer gesputterten magnetischen nanoporösen Membran. Beachten Sie die glatte Kante der NiFe-Schicht (blau). d SEM-Querschnittsbilder einer einzelnen Nanopore auf einer galvanisierten magnetischen nanoporösen Membran. Beachten Sie die scharfe Kante der NiFe-Schicht (blau). REM-Bilder der (e) gesputterten Membran und (f) der galvanisierten Membran. g Simulation der magnetischen Flussdichte (T) in Nanoporen auf ideal gesputterten magnetischen nanoporösen Membranen (oben) und idealen galvanisch beschichteten magnetischen nanoporösen Membranen (unten) und zeigt die dramatische Verstärkung der Flussdichte am Keil auf der galvanisch beschichteten MNM (Membrandicke links). rechts: 200 nm, 150 nm, 100 nm). h Simulation des Magnetfelds, die den Gradienten des Flussdichte-Normquadrats (T2/cm) am Keil sowohl auf idealen gesputterten magnetischen nanoporösen Membranen (oben) als auch auf idealen galvanisch beschichteten magnetischen nanoporösen Membranen (unten) zeigt (Membrandicke von links nach rechts: 200). nm, 150 nm, 100 nm).

Die Hochfeldverstärkung entsteht durch einen Wasserphasenmonopol am oberen Rand des NiFe-Films, wo der Keilwinkel auf der superparamagnetischen NiFe-Phase mit hoher Permeabilität etwa π/2 beträgt, und durch einen Dipol in der NiFe-Phase am äußeren Rand Basis der Keilverbindung, wobei der Keilwinkel auf der NiFe-Seite ~3π/2 beträgt. Beim Übergang in die Wasserphase mit einer um den Faktor 40 geringeren magnetischen Permeabilität kommt es zu einer zusätzlichen Verstärkung des Dipolfeldes. In der gesputterten Membran haben wir aufgrund der glatten Kante nur einen schwachen oberen Monopol (Abb. 2g). Diese Kombination aus Dipol- und Monopolfeld an den scharfen Kanten des galvanisierten NiFe-Films ist für den 10-fachen Anstieg der Einfangkraft der Nanokügelchen verantwortlich, und wir erwarten, dass wir bei superparamagnetischen Nanokügelchen einen ähnlichen Anstieg der Einfangausbeute beobachten werden.

Um die Einfangeffizienz des MNM mit dem mehrkantigen superparamagnetischen Keil um jede Nanopore zu testen, haben wir eine Gehäusevorrichtung für MNM-Immuneinfanganwendungen entworfen, die in der Ergänzenden Anmerkung 3 beschrieben wird. Während der Experimente wurden runde Membranen mit 2 cm Durchmesser getestet . Kurz gesagt, 1 ml 10 × verdünnte 30-nm-Nanokügelchen aus dem Exosome Isolation Kit Pan (Maus, Miltenyi Biotec) wurden mit 1 ml/h durch die galvanisierte nanoporöse 450-nm-Membran (PET-Porengröße) geleitet. Bei allen Experimenten liegt die Menge an Nanokügelchen unter dem Sättigungsgrad des MNM. Abbildung 3b zeigt die Perlenlösung vor und nach dem magnetischen Einfangen auf der Membran; Die bräunliche Farbe der Perlen verschwindet vollständig in der Durchflusslösung, was auf eine hohe Effizienz beim Einfangen der Perlen hinweist. Nanokügelchen, die durch oberflächennahe Stromlinien konvektioniert werden, werden vom Monopol nahe der Oberkante des NiFe-Films eingefangen, wie in Abb. 3a dargestellt. Die verbleibenden Perlen werden in das Porenzentrum konvektiert und durch die hohe Dipolmagnetkraft in der Pore gefangen (Abb. 3c). Zur Validierung der EV-Erfassungsfähigkeit des MNM wurde gesundes Mausplasma verwendet (Einzelheiten in der Ergänzenden Anmerkung 4). Das SEM-Bild (Abb. 3d) zeigt das Mausplasma-Exosom, das an Nanokügelchen angedockt ist, die in der Nähe der Nanopore eingefangen wurden.

ein REM-Bild von durch das Monopolfeld eingefangenen Magnetkügelchen in der Nähe der Ränder von Nanoporen. Der Durchmesser der Pore hat sich nach der Abscheidung verschiedener Metallschichten auf etwa 300 nm verringert. b Lösung von Perlen vor dem Durchgang durch die magnetische nanoporöse Membran (links) und nach dem Filtern durch die magnetisierte Membran (rechts). Die gelbe Farbe zeigt die konzentrierten Perlen an. c Das vergrößerte REM-Bild zeigt Nanokügelchen, die durch das Dipolfeld der Keilverbindung in einer einzelnen Nanopore eingefangen werden. d SEM-Bild des Mausplasma-Exosoms, aufgenommen in der Nähe der Nanopore. e Perleneinfangeffizienz von gesputterten und galvanisierten Membranen bei unterschiedlichen Flussraten und Porengrößen. Für die galvanisierte Membran wurden die ursprüngliche Porengröße von 450 nm und 1 μm und Flussraten von 1, 5 und 10 ml/h getestet. Für die gesputterte Membran wurden die ursprüngliche Porengröße von 450 nm und eine Durchflussrate von 1 ml/h getestet (n = 3 unabhängige Experimente). Fehlerbalken geben die Standardabweichungen (SD) für jede Bedingung an.

Die Porengröße schrumpft nach dem Galvanisieren von 450 auf etwa 350 nm, was immer noch größer ist als die typische kleine EV-Größe (sEV) von 30–200 nm, sodass Nicht-Ziel-EVs ohne Nanokügelchen passieren können. Eine quantitative Studie zur Effizienz des Perleneinfangens wurde durchgeführt, indem die durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) gemessene Perlenkonzentration vor und nach dem Einfangen verglichen wurde (siehe Abb. 3e). Bei 1 ml/h wurden >99 % der Perlen eingefangen. Selbst bei einer Flussrate von 5 ml/h verringerte sich die Effizienz der Perlenerfassung nicht. Dieser Durchsatz ist hoch genug für die meisten extrazellulären Vesikel-Immunocapture-Anwendungen. Darüber hinaus gingen nur 13 % der Perlen verloren, wenn die Flussrate auf 10 ml/h erhöht wurde. Bei Membranen mit einer Porengröße von 1 μm betrug die Perleneinfangeffizienz bei 1 ml/h immer noch >80 %. Im krassen Gegensatz dazu wurden nur 22 % der Perlen von der gesputterten 450-nm-Membran eingefangen (Abb. 3e). Für größere Vesikel über 300 nm kann galvanisiertes MNM mit einer Porengröße von 1 μm bei einer niedrigeren Flussrate oder mit einem höheren externen Magnetfeld verwendet werden.

Basierend auf der Wirksamkeit des MNM bei der Erfassung von Elektrofahrzeugen wollten wir die Fähigkeit dieser Methode zur Erfassung von Lipoproteinen, insbesondere HDLs, untersuchen (Abb. 4a). HDLs sind in Plasma und anderen Bioflüssigkeiten sehr häufig anzutreffen und bieten ein gutes Modell zur Rückverfolgung auf der Grundlage von Standard-Cholesterintests, mit denen sie quantifiziert werden können. Apolipoprotein AI (apoA-I) ist das wichtigste Struktur-Funktionsprotein auf der Oberfläche von HDL-Partikeln. ApoA-I ist hauptsächlich mit HDL assoziiert und macht etwa 70 % des gesamten HDL-Proteingehalts aus. HDL-Proben wurden durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (DGUC) aus menschlichem Plasma isoliert und die Gesamtproteingehalte wurden durch kolorimetrische Tests quantifiziert32. Zum Einfangen wurden 2 μg Anti-ApoA-I-Antikörper (Abcam, ab52945, monoklonal gegen ApoA1 vom Kaninchen) mit 100 μl einer 100 μg/ml HDL-Probe gemischt, 30 Minuten lang inkubiert und mit 100 μl Anti-Kaninchen-IgG-Nanokügelchen behandelt ( 30 nm, Milyteni Biotec) für 1 h. Nachdem das HDL durch die magnetischen Nanokügelchen immuneingefangen wurde, wurde die Lösung mit 1 × PBS auf 500 μl verdünnt und durch die 450 nm galvanisierte MNM-Membran geleitet, gefolgt von Spülen mit 1 ml 1 × PBS, um alle Kügelchen auf die Membran zu bringen Oberfläche und um die restliche HDL-Lösung in der Kammer zu entfernen. Für jede Probe wurde der Durchfluss erfasst. Da Cholesterin nur in den Lipoproteinen und nicht in den EVs vorhanden ist, wurde die Cholesterinkonzentration gemessen, um die Gesamtmenge an Cholesterin sowohl in der Originalprobe als auch im Durchfluss zu berechnen (Abb. 4b). Die Cholesterin-Capture-Rate kann wie folgt berechnet werden:

a Schematische Darstellung der Immunerfassung der HDL-Einfangrate unter Verwendung von Cholesterin als Maß. In den drei Fällen wurden unterschiedliche Kombinationen auf spezifisches Einfangen von HDL mit Anti-ApoA1-Antikörpern und unspezifisches Einfangen ohne Antikörper und Anti-ApoB-Antikörper, die spezifisch für LDL sind, getestet. b Erfassungsrate der drei Fälle in (a) (jeweils n = 3 Messungen). c Vergleich der HDL-Einfangrate mit verschiedenen Immunocapture-Kits, einschließlich der Miltenyi MACSTM μColumn und Thermofisher DynabeadsTM. Die eingefügten Schaltpläne zeigen das grundlegende Funktionsprinzip verschiedener Technologien. Die Inkubationszeit wurde für Dynabeads™ mit 1 Stunde und 16 Stunden gewählt (n = 7 Messungen für jede Methode). d Ct-Wert von miR-21 aus qRT-PCR-Experimenten. MiRNA-Proben wurden aus HDL extrahiert, das sowohl von MNM als auch von Dynabeads™ mit dem gleichen Ausgangsprobenvolumen erfasst wurde (n = 3 Messungen für jede Probe). Die Inkubationszeit des MNM-Experiments beträgt 1 Stunde und die von Dynabeads™ 12 Stunden. Die schematischen Darstellungen des Immunocaptures und der qRT-PCR wurden im Einschub gezeigt. Das HDL wurde durch MNM oder Dynabeads eingefangen und dann lysiert, gefolgt von miRNA-Extraktion und qRT-PCR. Fehlerbalken geben die Standardabweichung (SD) in jedem Diagramm an.

Bemerkenswerterweise wurden mit diesem Ansatz >80 % des HDL zurückgewonnen. Um die Spezifität des Immuncaptures und der unspezifischen Adsorption in unserem Gerät zu bestätigen, wurden zwei Negativkontrollen getestet. Wenn in den Experimenten keine Antikörper auf den Nanokügelchen funktionalisiert wurden, gingen <10 % des HDL im Gerät verloren, was auf unspezifische Adsorption und experimentelle Fehler zurückzuführen war. Wenn Antikörper (Abcam, ab139401, monoklonal gegen ApoB vom Kaninchen) gegen Apolipoprotein B, das Strukturprotein für Lipoproteine niedriger Dichte (LDL), anstelle von Anti-ApoA-I verwendet wurden, stieg der Verlust auf 14 %. Der zusätzliche Verlust von 4 % kann auf die unspezifische Erfassung von HDL durch Anti-ApoB zurückzuführen sein. Bei beiden Negativkontrollen ist die unspezifische Fangrate von <15 % deutlich niedriger als die spezifische Fangrate von 80 %. Wir haben unsere Methode anhand des Standardprotokolls mit einem kommerziellen Immunocapture-Kit verglichen (siehe Ergänzende Anmerkung 5). Wie in Abb. 4c gezeigt, wurden bei Nanokügelchen aufgrund der geringen Perlenfangeffizienz der gepackten Säule nur 20 % HDL von der μColumn (Milyteni Biotec) eingefangen. Darüber hinaus übersteigt die HDL-Einfangeffizienz bei Mikrokügelchen wie Dynabeads™ selbst nach 16-stündiger Inkubation, was viel länger als beim Standardprotokoll ist, nicht mehr als 50 %. Bei der gleichen Inkubationszeit von 1 Stunde wie bei den Nanokügelchen wurden nur 25 % HDL zurückgewonnen (ergänzende Abbildung S4), was einer unspezifischen Einfangrate von geringfügig > 15 % entspricht.

Um den Vorteil der MNM-Immunerfassungsmethode weiter zu demonstrieren, wurden miRNA-Extraktion und qRT-PCR-Quantifizierung von miR-21 an HDL durchgeführt, das sowohl von MNM als auch von Dynabeads™ erfasst wurde. Abbildung 4d zeigt einen Ct-Unterschied von mehr als 6 zwischen den beiden Immunocapture-Methoden, was darauf hindeutet, dass das miRNA-Expressionsergebnis von Dynabeads™ 64-fach niedriger ist als das von MNM (Delta-Delta-Ct-Methode). Die lange Inkubationszeit, die Mikrokügelchen erfordern, führt zu Probenabbau und miRNA-Abbau sowie Adsorption, was zu einer erheblichen Verzerrung bei der miRNA-Quantifizierung führt. Im Gegensatz dazu blieb beim schnellen MNM-Immunocapture eine hohe Konzentration an miR-21 erhalten.

In dieser Demonstration wurden 100 μl gesundes menschliches Plasma zunächst verdünnt und durch Tangentialflussfiltration mit asymmetrischen nanoporösen 30-nm-Membranen33 verarbeitet, um den größten Teil des HDL und anderer Lipoproteine zu entfernen (Abb. 5a). Wie in Abb. 5b gezeigt, waren nach der Filtration immer noch 17 % Cholesterin, hauptsächlich LDL und VLDL, übrig. Aufgrund der überwiegenden HDL-Menge im ursprünglichen Plasma könnte auch eine kleine Menge HDL in der gefilterten Probe vorhanden sein. Daher haben wir die gefilterte Probe mit 2 μg Anti-ApoA-I- und 2 μg Anti-ApoB-Antikörpern gemischt und 30 Minuten lang inkubiert. Diese Apolipoproteine sind spezifisch für die Lipoproteine, nicht jedoch für EVs. Nach Zugabe von 200 μl Anti-Kaninchen-IgG-MicroBeads (30 nm, Milyteni Biotec) und einstündiger Inkubation wurde die Mischung durch das MNM geleitet. Der gesammelte Durchfluss war die gereinigte EV-Probe, die 85 % des ursprünglichen EV aus der NTA-Charakterisierung in Abb. 5c, aber nur 5 % des ursprünglichen Cholesterins enthielt. Die Größenverteilung der EV-Probe blieb auch nach der Reinigung erhalten, wie in Abb. 5c dargestellt, was darauf hindeutet, dass MNM nicht nur 85 % der EVs in der Anzahl zurückhält, sondern auch die Lyse oder Koaleszenz von EVs vermeidet. Die ELISA-Ergebnisse für CD63 und CD9 in Abb. 5c bestätigten auch einen minimalen Verlust (13–17 %) vor und nach der MNM-Reinigung mit Anti-ApoA-I- und Anti-ApoB-Pulldown-Verfahren.

ein Schema der EV-Fraktionierung und Immunocapture von HDL. Das verdünnte Plasma (Probe I) läuft durch die asymmetrische nanoporöse Membran, um andere Partikel mit einem Größenausschlussmechanismus zu entfernen und so die EV-Fraktion (Probe II) zu erhalten. Aufgrund der dominierenden Menge an HDL verblieb ein kleiner Teil des HDL in der EV-Fraktion, daher wurde es mit Anti-ApoA1- und Anti-ApoB-Antikörpern inkubiert und dann magnetische Nanokügelchen, konjugiert mit Anti-Kaninchen-IgG-Antikörpern, durch das MNM-Gerät laufen lassen um das HDL zu entfernen, und der Durchfluss wurde gesammelt (Probe III). b Lipoproteine (Cholesterin), die in verschiedenen Reinigungsstadien aus den Proben I, II, III in a) zurückbleiben, und (Einschub) EV-Konzentration vor und nach der MNM-Immunerfassung (Probe II und III) (n = 5 Messungen für jede Probe). c Größenverteilung von EV-Proben mit NTA vor (Probe II) und nach MNM-Immunocapture (Probe III) mit minimalem EV-Verlust oder Lyse/Koaleszenz. (Einschub) CD63- und CD9-Konzentration vor und nach MNM-Immunocapture (Probe II und III), gemessen durch ELISA (n = 2 bzw. 3 Messungen für CD63, CD9). Fehlerbalken geben die Standardabweichung (SD) in jedem Diagramm an.

Eine wichtige Forschungsrichtung im Bereich Elektrofahrzeuge besteht darin, Elektrofahrzeuge zu identifizieren, die von bestimmten (erkrankten) Zellen oder über bestimmte Wege abgesondert werden14. In dieser Studie wurden Elektrofahrzeuge zunächst aus menschlichen Darmkrebszellen (DiFi) mithilfe einer größenbasierten ANM-Trenntechnologie (asymmetrische nanoporöse Membran) isoliert. Anschließend wurden spezifische EVs mit EGFR-Membranproteinen aus dem ANM-EV-Isolat vom MNM weiter isoliert, um die genaue miRNA-Quantifizierung einer bestimmten Unterklasse von EVs zu demonstrieren (Abb. 6a). Basierend auf der Analyse von EGFR-haltigen DiFi-Elektrofahrzeugen handelte es sich bei isolierten Elektrofahrzeugen aufgrund des Tetraspaningehalts wahrscheinlich um Exosomen34. Einige der von den DiFi-Zellen freigesetzten Elektrofahrzeuge zeigten inaktives EGFR und aktives EGFR34. In diesem Experiment verwendeten wir einen Gesamt-EGFR-Antikörper, der sowohl aktives als auch inaktives EGFR einfängt. DiFi-Zellkulturüberstände wurden zunächst durch Tangentialflussfiltration mit asymmetrischen nanoporösen 30-nm-Membranen33 verarbeitet, um frei schwebende Proteine zu entfernen. Kurz gesagt, 1 μg Anti-EGFR-Antikörper wurden der Probe zugesetzt und 30 Minuten lang inkubiert. Nach Zugabe von 100 μl Anti-Human-IgG-MicroBeads (30 nm, Milyteni Biotec) und einstündiger Inkubation wurde die Mischung durch das MNM geleitet. Western Blots von Syntenin-1 (als EV-Protein15,35) und EGFR werden sowohl an der ANM-isolierten Fraktion als auch an der MNM-eingefangenen Fraktion durchgeführt, um den EV-Gehalt zu validieren (Abb. 6e). Wir haben während des Prozesses miRNA aus allen Fraktionen extrahiert und eine qRT-PCR durchgeführt, um die miR-21-Spiegel zu bestimmen. Abbildung 6b zeigt den miRNA-Gehalt in den isolierten EGFR-EVs, und das Durchflussmaterial summiert sich mit einem Fehler von 21 % gleich zum gesamten miR-21-Gehalt in der Originalprobe, was unbedeutend ist, wenn man bedenkt, dass qRT-PCR nur zweifache Änderungen unterscheiden kann. Die Gesamtmenge an EGFR im ANM-Isolat und der MNM-Durchfluss werden ebenfalls mittels ELISA gemessen. Es wurde ein Rückgang von nahezu 90 % erreicht, was darauf hinweist, dass die meisten EGFRs im MNM-EGFR-Isolat eingefangen wurden (Abb. 6b, Einschub). Die CD63- und CD9-Konzentrationen im MNM-EGFR-Isolat betragen nahezu die Hälfte der Gesamtkonzentration vor der MNM-Einfangung (Abb. 6c), was mit dem miR-21-qRT-PCR-Ergebnis übereinstimmt (Abb. 6b). Um das Quantifizierungspotenzial unseres Systems weiter zu untersuchen, haben wir das gleiche Experiment sowohl mit unverdünnten als auch mit 8-fach verdünnten ANM-verarbeiteten DiFi-Proben durchgeführt. Wie in Abb. 6d gezeigt, entspricht die 8,3-fache Änderung des miR-21-Expressionsniveaus dem Verdünnungsfaktor, was darauf hindeutet, dass unsere hohe Effizienz bei verschiedenen anfänglichen Probenkonzentrationen konsistent ist, was für quantitative Biomarkerstudien wichtig ist.

ein Schema der EV-Fraktionierung und Immunocapture von EV mit EGFR. Das DiFi-Zellkulturmedium wurde durch die asymmetrische nanoporöse Membran geleitet, um die EV-Fraktion durch Größentrennung zu erhalten (Probe I), die dann mit den Anti-EGFR-Antikörpern und anschließend mit magnetischen Nanokügelchen, konjugiert mit Anti-Human-IgG-Antikörpern, inkubiert wurde. Anschließend passierten die Proben das MNM-Gerät, wobei die auf der Magnetmembran eingefangene Probe mit Lysepuffer vermischt wurde (Probe II) und der Durchfluss gesammelt wurde (Probe III). b Hm-miR-21-Expressionsniveau verschiedener DiFi-Exosomenfraktionen aus den Proben I, II, III in (a) (n = 3 Messungen für jede Probe). (Einlass) Die Gesamtmenge an EGFR wurde für I und III gemessen, was darauf hinweist, dass die meisten EGFR-positiven EVs aus den ANM-isolierten EVs von MNM erfasst werden (n = 7 Messungen für jede Probe). c CD63- und CD9-Konzentration von ANM-Isolat (Probe I) und MNM-EGFR-Isolat (Probe II), gemessen durch ELISA. (n = 3 Messungen für jede Probe) d Expressionsniveau von Hm-miR-21 in den EGFR-Exosomen vor und nach 8-facher Verdünnung der DiFi-Proben und der Ct-Wert ihrer qRT-PCR-Ergebnisse (n = 5 Messungen für jede Probe ). e Western Blot der isolierten Elektrofahrzeuge aus der DiFi-Zelllinie. Nach der Markierungsspur dann (1) ANM-isoliertes sEV; (2) MNM-Kügelchen eingefangenes sEV. Jede Vertiefung wurde mit 40 µg Protein beladen. Odyssee-Belichtung (unten: 10 Min., oben: überbelichtet). Das obere Feld ist jeweils mit EGFR und das untere mit Syntenin-1 geblottet. Fehlerbalken geben die Standardabweichung (SD) in jedem Diagramm an.

Hier haben wir den Nutzen und die Effizienz galvanischer MNM mit einzigartigen heterogenen superparamagnetischen Übergängen demonstriert. Mit dieser Methode kann eine hocheffiziente Erfassung superparamagnetischer Nanokügelchen erreicht werden. Wir haben mit einem einzigen Gerät eine nahezu 100-prozentige Rückgewinnung der Nanokügelchen aus der Lösung bei bis zu 5 ml/h erreicht. Die nicht eingefangenen Elektrofahrzeuge können durch die geraden Poren gelangen und im Durchfluss gesammelt werden. Wir haben die Effizienz und Spezifität unseres Geräts anhand von HDL als Modell nachgewiesen, wobei >80 % der HDL-Partikel zurückgewonnen wurden und die unspezifische Retention mit weniger als 15 % minimal war. Die hohe und konstante Ausbeute unseres Systems bietet Quantifizierungspotenzial für Studien von Elektrofahrzeugen, Lipoproteinen und anderen extrazellulären RNA-Trägern. Wir haben außerdem die Leistung von MNM bei der Erfassung von Exosomen, der Reinigung von HDL-angereicherten EV-Proben und der Charakterisierung von EGFR-positiven EVs demonstriert. Das direkte Lyseprotokoll in dieser Studie ist auf eine Vielzahl nachgelagerter Analysen zur Biomarker-Entdeckung und -Diagnose anwendbar, wie z. B. qRT-PCR, MS-basierte Proteomik, Sequenzierung usw. Für die Arzneimittelabgabe, Gewebezüchtung und andere Anwendungen, die intakte Elektrofahrzeuge erfordern, wie z Für Mobilfunkanbieter ist ein EV-Freigabeprotokoll erforderlich. Dissoziationspuffer36,37, fotospaltbare Linker38 und Protease-sensitive Linker39 sind mögliche Strategien, um die EVs vom MNM zu lösen. Unsere Plattform ist auch für andere molekulare oder virale Immunocapture-Anwendungen anwendbar, bei denen Capture-Effizienz und Durchsatz von entscheidender Bedeutung sind. Neben der Isolierung spezifischer EVs aus Plasma für Flüssigbiopsie-Anwendungen (Krankheitsscreening und Therapiemanagement) dürfte die MNM-Technologie auch für die Entdeckung von Biomarkern aus Zellkulturen nützlich sein, wie wir hier für die DiFi-Probe und auch für Organe gezeigt haben -On-the-Chip- oder Organoid-Modelle35,40,41,42.

Mit COMSOL wurden verschiedene Nanoporenstrukturen modelliert und simuliert, um die magnetische Flussdichte und ihren Gradienten abzuschätzen. Ein zweidimensionales (2D) axialsymmetrisches Geometriemodell wurde mit der Schnittstelle „Magnetische Felder, keine Ströme“ im AC/DC-Modul verwendet. Es wurde die in die Software integrierte NiFe-BH-Kurve verwendet. Am äußersten Rand des Modells wurde eine statische magnetische Flussdichte von 0,5 T angewendet. Die Simulation wurde mit einer physikgesteuerten Vernetzung extrem feiner Elemente durchgeführt. Weitere Einzelheiten finden Sie in der Ergänzenden Anmerkung 1.

Oberflächen-REM-Bilder wurden mit Magellan 400 aufgenommen. Für EV-erfasste Membranen wurde eine 2 %ige wässrige Paraformaldehydlösung in EMS-Qualität zur Fixierung verwendet und zur Leitfähigkeit wurde vorab 2 nm Gold aufgesputtert. Vesikel wurden bei niedrigen Strahlenergien untersucht. Querschnitte der Nanoporen wurden mit dem Helios G4 UX DualBeam (Thermo Scientific) erstellt. Nach dem Schutz der Querschnittsoberfläche mit Pt-EBID wurden nacheinander Scheiben mit einer Dicke von 5 nm mit der Software Auto Slice & View™ 4 (AS&V4) erhalten, die mit einem fokussierten 10-keV-Galliumionenstrahl arbeitete. Das Schneiden wurde in der Mitte der Pore gestoppt und die Bilder wurden mit einer Spannung von 3 kV unter Verwendung eines TLD-Detektors für Sekundärelektronen aufgenommen.

Die verwendeten spurgeätzten PET-Folien (PET115745, Wuwei Kejin Xinfa) sind 11 µm dick und haben eine Porendichte von 5 × 107/cm2. Zur Herstellung der galvanisierten magnetischen nanoporösen Membran wurden 80 nm Au in einem FC-1800-Verdampfer auf die spurgeätzten PET-Filme abgeschieden. Die Goldschicht sorgt für eine gute Haftung zwischen Polymer und NiFe und fungiert als Keimschicht für die Galvanisierung. Die Membran wurde in 4 cm × 4 cm große Stücke geschnitten. Mithilfe von Kupferbändern wurden die Membranen auf dem Träger befestigt und elektrisch mit der Kathode verbunden. Als Anode wurde eine Nickelplatte verwendet. Die aus der Literatur übernommene Galvanisierungslösung43,44 ist in der Ergänzenden Anmerkung 6 zu finden. Eine konstante Stromdichte von 2 mA/cm2 wurde mit dem Keithley 2636A Dual-Channel System SourceMeter angewendet; Die Spannung wird während des Galvanisierungsprozesses überwacht. Für eine gleichmäßige Abscheidung wurde ein spezieller Galvanik-Rührtank entwickelt. Die Ablagerungsrate wurde durch REM-Bilder von dickeren Proben abgeleitet, die unter den gleichen Bedingungen gezüchtet wurden. Ein weiteres 10 nm dickes Au wurde oben auf der NiFe-Schicht abgeschieden, um unspezifische Adsorption und chemische Instabilität zu reduzieren. Weitere Charakterisierungen der Membranen sind in der Ergänzenden Anmerkung 2 aufgeführt.

Wie bei den galvanisierten Proben wurde zunächst 80 nm großes Au auf den PET-Filmen abgeschieden. Die gesputterten Proben wurden bei Raumtemperatur in einem kommerziellen UHV-Sputtersystem Oerlikon DCSS unter Verwendung eines Ni80Fe20-Targets hergestellt. Der Ar-Gasfluss wurde auf 20 sccm festgelegt und die Plasmaleistung betrug während der Abscheidung 50 W. Die Abscheidungsrate wurde mithilfe eines Stiftprofilometers und REM-Bildern von dickeren Proben ermittelt, die unter den gleichen Bedingungen gezüchtet wurden. Nach dem Sputtern wurden 10 nm Au oben auf der NiFe-Schicht abgeschieden.

Nicht identifizierte Plasmaproben wurden von Zen-Bio Inc. erhalten und bestanden aus 10 ml frischem menschlichem Plasma, das in Röhrchen mit EDTA-Koagulans gesammelt wurde. Jede Probe wurde gemäß den Anforderungen der FDA auf Krankheitserreger getestet. Alle in Studien mit menschlichen Teilnehmern durchgeführten Testprotokolle entsprachen den ethischen Standards der University of Notre Dame.

DiFi-Zellen wurden in einem C2011 FiberCell-Bioreaktor mit 20-kDa-Poren unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers (FiberCell Systems, New Market, MD) unter Verwendung der definierten serumfreien Medien (CDM-HD) von FiberCell Systems gezüchtet. Insbesondere wurde der Bioreaktor über Nacht mit sterilem 1 × DPBS (Corning, Corning, NY) und dann über Nacht mit DMEM mit hohem Glucosegehalt (hgDMEM/Corning) gewaschen. Der Bioreaktor wurde 4 Stunden bis über Nacht mit 0,5 mg Rinderfibronektin (Sigma, St. Louis, MO) in 20 ml DMEM behandelt. Der Bioreaktor wurde dann über Nacht mit vollständigem hgDMEM mit 10 % Rinderwachstumsserum (1 % Penicillin-Streptomycin [Pen/Strep, GIBCO, Dublin/Irland], 1 % Glutamin [GIBCO], 1 % Glutamin [GIBCO], 1 % nicht essentiell) gewaschen Aminosäuren [GIBCO]). Der Bioreaktor wurde mit 1–5 × 108 DiFi-Zellen in vollständigem hgDMEM mit 10 % Serum beladen und 1 Stunde stehen gelassen, bevor vollständiges DMEM mit 10 % Serum zirkuliert wurde. Der Glukosespiegel wurde täglich mit einem Glukometer (CESCO Bioengineering, Trevose, PA) überwacht, und als der Glukosespiegel halb so hoch war wie im Ausgangsmedium, wurde die Medienflasche ausgetauscht. Bei nachfolgenden Medienwechseln wurde der Bioreaktor von 10 % Rinderserum auf 5 % und dann auf 3 % umgestellt, bevor auf 10 % CDM-HD (DMEM-HD)-Medium umgestellt wurde. Sobald die Zellen in DMEM-HD etabliert waren (mindestens 2 Wochen in DMEM-HD), wurde eine routinemäßige Ernte konditionierter Medien durchgeführt, wobei 20 ml konditioniertes Medium pro Tag entfernt wurden. Das gesammelte Medium wurde mit 2000 U/min geschleudert, um Zellen und alle großen Trümmer zu entfernen. Anschließend wurde ein Teil des Mediums zusätzlich durch einen Millex-Spritzenfilter mit 0,22 µm Poren (Millipore Sigma, Burlington, MA) schwerkraftfiltriert. Mindestens 3 Tage gefilterter Mediensammlungen wurden gepoolt.

Plasma wurde von eingewilligten menschlichen Teilnehmern unter aktiven Vanderbilt-IRB-Protokollen und -Anleitungen gesammelt. Das Blut wurde in EDTA-haltige Sammelröhrchen entnommen und sofort zentrifugiert, um das Plasma abzutrennen. HDL und LDL wurden aus menschlichem Plasma durch KBr-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (DGUC) isoliert, wie zuvor beschrieben32. Kurz gesagt, natives LDL (1,019–1,062 g/L) und HDL (1,063–1,021 g/L) wurden durch sequentielles DGUC unter Verwendung einer Optima XPN-80-Ultrazentrifuge mit SW41Ti- oder SW32Ti-Rotoren (Beckman-Coulter) isoliert. HDL und LDL wurden in PBS mit >4 Pufferwechseln dialysiert und mit 3000-Da-MW-Cutoff-Filtern (Millipore) konzentriert. Die Gesamtproteingehalte wurden für jede Lipoproteinprobe (HDL und LDL) durch kolorimetrische BCA-Assays (Pierce, ThermoFisher) bestimmt.

Magnetische Nanokügelchen werden von Miltenyi gekauft und unverändert verwendet. Diese Nanokügelchen sind 20–30 nm groß (mit REM überprüft) und mit Antikörpern funktionalisiert. Es werden Exosome Isolation Kit Pan, Maus (Kat.-Nr. 130-117-039), Anti-Kaninchen-IgG-Mikrokügelchen (Kat.-Nr. 130-048-602) und Anti-IgG-Mikrokügelchen, Mensch (Kat.-Nr. 130-047-501) verwendet für jedes Experiment.

Das Cholesterin-Quantifizierungs-Assay-Kit (Sigma-Aldrich, CS0005) wurde zur Messung der Cholesterinkonzentration von Proben verwendet. Kurz gesagt, 44 μl Assay-Puffer, 2 μl Sonde, 2 μl Enzymmischung, 2 μl Cholesterinesterase und 50 μl Probe wurden gemischt und 30 Minuten lang bei 37 °C in jeder Vertiefung inkubiert. Für jede Messung wurde eine Kalibrierungskurve mit Standardproben mit 0–5 μg Cholesterin erstellt. Alle Proben wurden mit dem Testpuffer auf den Bereich der Kalibrierungskurve verdünnt. Die Absorption bei 570 nm wurde gemessen und mit den Standards auf derselben Platte verglichen, um das Gesamtcholesterin zu bestimmen.

miRNAs wurden aus Proben mit dem NucleoSpin® miRNA Plasma Kit (Takara Bio) gemäß dem Handbuch des Herstellers isoliert. 300 μl der Probe wurden zunächst mit 90 μl MLP-Lösung gemischt und 3 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 30 μl MPP-Puffer und einer 1-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. 3,5 μl (1,6 × 108 Kopien/μl) cel-miR-39-3p in RNase-freiem Wasser wurden dem Lysat als zugegebene Normalisierungskontrolle zugesetzt. Anschließend wurde die Mischung bei 11.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen und mit 400 μL Isopropanol vermischt. Die Mischung wurde in die Bindungssäule überführt und 30 s lang bei 11.000 × g zentrifugiert. Die Säule wurde dann 30 s lang nacheinander mit 100 μl MW1 und 700 μl MW2 bei 11.000 × g gewaschen, gefolgt von 250 μl MW2 Waschen und Trocknen bei 11.000 × g für 3 Minuten. Abschließend wurden 30 μl RNase-freies Wasser zugegeben, um die miRNA nach 1-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur 1 Minute lang bei 11.000 × g zu eluieren. Die Reverse Transkription wurde mit einem miScript II RT Kit (Qiagen) durchgeführt. Eine 20 μl Reverse-Transkriptionsreaktion wurde mit 2,2 μL eluierter miRNA, 4 μL 5 × miScript HiSpec-Puffer (Qiagen), 2 μL 10 × miScript Nucleics Mix (Qiagen), 9,8 μL RNase-freiem Wasser und 2 μL miScript Reverse Transkriptase vorbereitet Mischen (Qiagen). Die Reaktion wurde 60 Minuten lang bei 16 °C und anschließend 5 Minuten lang bei 95 °C inkubiert. Die Reverse-Transkriptionsreaktion wurde dann mit 200 μl RNase-freiem Wasser verdünnt. Dreifache der qPCR-Reaktionen wurden mit dem miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen) durchgeführt und auf einem StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems) ausgeführt. Die Reaktion enthielt 2 μl verdünnte cDNA, 12,5 μl 2·QuantiTect® SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen), 2,5 μl 10·miScript Universal Primer (Qiagen), 10·miScript Primer Assay (Qiagen) für die Ziel-miRNA und 5,5 μl RNase-freies Wasser in einem Endvolumen von 25 μL. Die Reaktionsmischungen wurden 15 Minuten lang bei 95 °C inkubiert, gefolgt von 45 Zyklen bei 94 °C für 15 Sekunden, 55 °C für 30 Sekunden und 70 °C für 30 Sekunden. Die Ct-Werte wurden mit der StepOne™ Software v2.3 gemäß den MIQE-Richtlinien45 erfasst und analysiert. Die Ct-Werte der Ziel-miRNAs wurden durch zugesetzte Standardkontrolle (cel-miR-39-3p) angepasst, die während der miRNA-Extraktion hinzugefügt wurde. Das Expressionsniveau wird mit der Delta-Delta-Ct-Methode berechnet.

Das humane EGFR-ELISA-Kit (EGFR0, R&D Systems™), das humane CD63-ELISA-Kit (Kat.-Nr. EH95RB, Invitrogen) und das humane CD9-ELISA-Kit (#MBS7607059, MyBioSource) wurden verwendet, um spezifische Proteine in den Proben jeweils gemäß den Anweisungen des Herstellers zu quantifizieren . Die aus den MISEV2018-Richtlinien46 ausgewählten EV-Marker CD9 und CD63 wurden in EV-Proben in unterschiedlichen Konzentrationen nachgewiesen. Für jede Platte wurden Standardkurven erstellt und die Proteinkonzentrationen anhand der Messwerte bestimmt.

Western Blots wurden gemäß dem zuvor beschriebenen allgemeinen Protokoll durchgeführt47. Kurz gesagt, die Proteine wurden durch BCA (Thermo, Kat.-Nr. 23235) unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers quantifiziert. Vierzig Mikrogramm Protein wurden in jede Spur eines 11 %igen SDS-Polyacrylamidgels geladen und etwa 5 Stunden lang bei 160 V einer Elektrophorese unterzogen. Aufgelöste Proteine wurden über Nacht bei 4 °C und 25 Volt auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und dann 4–5 Stunden lang mit Intercept-Blockierungspuffer (Li-COR, Kat.-Nr. 927-60001) blockiert. Nitrozellulosemembranen wurden zum Blotten in Molekulargewichtsbereiche geschnitten, basierend auf dem scheinbaren Molekulargewicht, wie durch Größenstandards (Bio-Rad, Kat.-Nr. 1610374) gekennzeichnet. Für die Immunoblots wurden EGFR-Antikörper (Millipore Rb, 1:1000, Kat.-Nr. 06-847) und Syntenin-Antikörper (Abcam, Rb, 1:5000, Kat.-Nr. Ab133267) verwendet. Für diese Marker wurde jeweils oben, in der Mitte und unten Nitrozellulose eingeschnitten. Die Blots wurden dann mit sekundärem Ziegen-Anti-Kaninchen-IRDye 800 CW (LI-COR, 1:5000, Kat.-Nr. 926-32213) sondiert. Membranen wurden von Odyssey (Li-COR) entwickelt.

Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) wurde mit einem NanoSight NS300 (NanoSight Ltd., Amesbury, UK) gemäß den MISEV2018-Richtlinien46 durchgeführt. Alle Proben wurden vor den Messungen mit 1 × PBS auf den optimalen Arbeitspartikelbereich verdünnt. Von jeder Probe wurden fünf 60-s-Videos aufgezeichnet, wobei die Kamerastufe auf 10 eingestellt war. Während der Aufzeichnung wurde eine konstante Flussrateneinstellung von 1000 beibehalten. Während der gesamten Messung wurde die Temperatur überwacht. Das Instrument wurde zwischen den Messungen mit 1 × PBS gespült. Für jede Probe aufgezeichnete Videos wurden mit der NTA-Software analysiert, um die Konzentration und Größenverteilung der gemessenen Partikel mit dem entsprechenden Standardfehler zu bestimmen. Für die Analyse wurde die gleiche Nachweisschwelle verwendet.

Die Anzahl der durchgeführten biologischen Replikate und Messungen wird in jeder Abbildung erläutert. Die Standardfehler aller Datensätze werden mit der Software OriginPro berechnet, grafisch dargestellt und manuell noch einmal überprüft. Die Daten werden als einzelne Datenpunkte und als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten für Grafiken und Diagramme finden Sie in den Zusatzdaten zu diesem Artikel. Weitere Daten, die zu dieser Studie beigetragen haben, finden Sie in den Zusatzinformationen. Die unbeschnittenen und unbearbeiteten Gelbilder sind in der ergänzenden Abbildung S7 enthalten. Alle weiteren Daten zu dieser Arbeit können bei den entsprechenden Autoren angefordert werden.

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Die Autoren bedanken sich für die Unterstützung des NIH Common Fund durch das Office of Strategic Coordination/Office of the NIH Director, 1UH3CA241684-01. CZ dankt für die Unterstützung durch ein Stipendium des China Scholarship Council. RJC erkennt die Unterstützung von NCI R35 CA197570 an. Die Autoren danken für die Unterstützung des Cancer Cure Venture (CCV) Grant, ermöglicht durch die Walther Cancer Foundation.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Chenguang Zhang, Xiaoye Huo.

Abteilung für Chemie- und Biomolekulartechnik, University of Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, USA

Chenguang Zhang, Xiaoye Huo, Satyajyoti Senapati und Hsueh-Chia Chang

Abteilung für Biologie, University of Notre Dame, Notre Dame, IN, 46556, USA

Yini Zhu & Xin Lu

Medizinische Fakultät, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, 37232, USA

James N. Higginbotham, Zheng Cao, Jeffrey L. Franklin, Kasey C. Vickers und Robert J. Coffey

Abteilung für Zell- und Entwicklungsbiologie, Vanderbilt University School of Medicine, Nashville, TN, 37232, USA

Jeffrey L. Franklin und Robert J. Coffey

Aopia Biosciences, 31351 Medallion Dr, Hayward, CA, 94544, USA

Ceming Wang

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CZ, XH, CW und HCC hatten die Idee und gestalteten die Studie. CZ führte die Finite-Elemente-Simulationen durch. CZ, XH, CW und ZC führten die Experimente durch. CZ analysierte die Ergebnisse und verfasste das Manuskript unter Einbeziehung aller Autoren. YZ, LX, JNH, JLF, KCV und RJC lieferten biologische Proben. CW, SS und HCC überwachten das Projekt.

Korrespondenz mit Ceming Wang oder Hsueh-Chia Chang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Shi Hu, Yuanjin Zhao und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Huan Bao und Gene Chong. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, C., Huo, X., Zhu, Y. et al. Galvanisch abgeschiedene magnetische nanoporöse Membran für die Immuneinfangung von extrazellulären Vesikeln und Lipoproteinen mit hoher Ausbeute und hohem Durchsatz. Commun Biol 5, 1358 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04321-9

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Eingegangen: 12. Mai 2022

Angenommen: 30. November 2022

Veröffentlicht: 10. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04321-9

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