Antibiofilm-Effekt verstärkt durch Modifikation von 1,2,3

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 24289 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Biofouling beeinträchtigt die Leistung von Membranbioreaktoren. In dieser Studie untersuchten wir die Antifouling-Wirkung von Polysulfonmembranen, die mit 1,2,3-Triazol- und Palladium (Pd)-Nanopartikeln modifiziert wurden. Die modifizierten Membranen wurden auf ihre antibakterielle und Antifouling-Wirksamkeit in einem Monokultur-Biofilm-Experiment (d. h. Drip-Flow-Biofilm-Reaktor, DFR) und einem Biofilm-Experiment mit gemischten Arten (d. h. aerober Membranreaktor, AeMBR) untersucht. 1,2,3-Triazol und Pd-Nanopartikel hemmten das Wachstum von Pseudomonas aeruginosa sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen. Die Abnahme des Bakterienwachstums wurde zusammen mit einer Abnahme der Menge an Gesamtpolysaccharid in der Biofilmmatrix der Monokulturarten beobachtet. Wenn die modifizierten Membranen mit AeMBR verbunden wurden, war der Anstieg des Transmembrandrucks geringer als der der nicht modifizierten Membranen. Dies ging mit einer Abnahme der Protein- und Polysaccharidkonzentrationen innerhalb der Biofilmmatrix gemischter Arten einher. Die Biomassemenge in der Biofilmschicht war in Gegenwart modifizierter Membranen ebenfalls geringer und es gab keine nachteilige Auswirkung auf die Leistung des Reaktors, wie anhand der Nährstoffentfernungsraten ermittelt wurde. Die 16S-rRNA-Analyse führte die Verzögerung der Membranverschmutzung außerdem auf die Abnahme der relativen Häufigkeit ausgewählter Bakteriengruppen zurück. Diese Beobachtungen deuten zusammengenommen darauf hin, dass die modifizierten Membranen zu einem geringeren Fouling-Aufkommen führen.

Membranbioreaktoren (MBR) werden zunehmend als bevorzugte Biotechnologie zur Abwasserbehandlung eingesetzt, da durch die Kopplung eines Membrantrennverfahrens eine verbesserte Abwasserqualität erzielt werden könnte. Membranen können auch verwendet werden, um katalytische Metalle (z. B. Manganoxid, Palladium) in den Bioreaktoren zurückzuhalten. Die katalytischen Metalle wiederum bewirken eine reduktive Hydrodehalogenierung von Schadstoffen (z. B. Arzneimittel und Körperpflegeprodukte, Biozide und organische Mikroschadstoffe), die sonst in einem herkömmlichen Belebtschlammverfahren nicht leicht biologisch abgebaut werden könnten. Zur Demonstration wurde Palladium (Pd) als katalytisches Metall verwendet, um eine reduktive Entfernung von Arzneimitteln, Bioziden und jodhaltigen Kontrastmitteln zu erreichen1. In ähnlicher Weise wurde Pd in einem kontinuierlichen Plattenmembranreaktor verwendet, um eine vollständige, effiziente und schnelle Entfernung von Trichlorethen (TCE)2 zu erreichen. In beiden Fällen wurde Pd entweder durch den Einsatz von Hohlfaser-Nanofiltrationsmembranen physikalisch im MBR zurückgehalten oder in Form einer Suspension durch das Reaktorsystem rezirkuliert. Das Fehlen eines Trägermaterials für diese Nanopartikel kann jedoch zur Agglomeration und zum Wachstum von Nanopartikeln führen, was zu einer anschließenden Verringerung der katalytischen Wirkung führt3,4.

Alternativ können Pd-Partikel auf Membranoberflächen eingebettet werden, um eine gleichmäßige Verteilung dieses Katalysators über die gesamte reaktive Oberfläche zu erreichen. Beispielsweise kapselten Hennebel und Mitarbeiter Pd-Partikel in Polyvinylidenfluorid-Membranen ein und zeigten, dass solche modifizierten Membrankontaktoren bei der Behandlung von Diatrizoat-kontaminiertem Wasser verwendet werden können5. Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass Pd-haltige Membranen im Laufe des Reaktorbetriebs anfällig für die Ablagerung von Biofouling sind. Dies liegt daran, dass Pd-Nanopartikel im Gegensatz zu einigen Schwermetallen wie Silber- oder Kupfernanopartikeln, die starke antibakterielle Wirkungen zeigen6,7,8,9, nur schwache und selektive antibakterielle Wirkungen haben10. Biofouling wirkt sich besonders nachteilig auf die Leistung von Membranbioreaktoren aus, da es zu einer verminderten Permeatproduktion, einem erhöhten Transmembrandruck und einer kürzeren Lebensdauer des Membranmoduls führen kann11. Darüber hinaus können Biofoulingstoffe wie Proteine und Polysaccharide die Katalysatoroberfläche vergiften und zu einer geringen katalytischen Aktivität führen.

Eine Strategie zur Überwindung dieser Einschränkung wäre der Einbau funktionell aktiver chemischer Gruppen in die Pd-verkapselten Membranen. Ein Beispiel für eine solche funktionell aktive chemische Gruppe sind die Triazolliganden. Es wurde festgestellt, dass Triazolliganden zytotoxische Wirkungen auf Krebszellen haben12. Es kann auch mit Cytochrom P450 interagieren, das wiederum die Biosynthese von Ergosterol in Pilzen hemmt. Das Endergebnis ist eine nachteilige Auswirkung auf die membrangebundenen enzymatischen Aktivitäten und die Membranpermeabilität für die Pilzzellen13,14. Darüber hinaus zeigten Triazolliganden antibakterielle Wirkungen, indem sie die Biosynthese von C-55-Isoprenoidalkohol und Vitamin K hemmten. Der Mangel an C-55-Isoprenoidalkohol würde wiederum die Biosynthese der bakteriellen Zellwand und des Membranpolymers beeinträchtigen; und der Mangel an Vitamin K würde sich nachteilig auf den Elektronentransport grampositiver Bakterien auswirken15.

Bisher gibt es nur begrenzte Studien, die die Verwendung von Triazolliganden als Antifoulingmittel in Polymermembranen belegen. Eine frühere Studie hatte gezeigt, dass triazolhaltiges Polymer eine hemmende Wirkung auf die Anzahl suspendierter und anhaftender Pseudomonas aeruginosa-Zellen hatte, die aus einer Polymermembran gewonnen wurden16. Obwohl davon ausgegangen wird, dass eine antibakterielle Wirkung mit einer Verzögerung des Auftretens von Membranverschmutzung einhergeht, konnte in der Studie nicht nachgewiesen werden, dass antibakterielle Membranen in einem betriebsbereiten Membranbioreaktor zur Erzielung einer verzögerten Membranverschmutzung eingesetzt werden können. In der Studie wurde auch nicht untersucht, wie Triazol-Liganden eine Antifouling-Wirkung erzielen, wenn sie auf Membranen funktionalisiert werden, oder ob eine synergistische Antifouling-Wirkung in Gegenwart von Triazol und Pd erzielt werden kann.

In dieser Studie schlagen wir die Einbettung von Pd in eine mit 1,2,3-Triazol funktionalisierte PSU-Membran vor, um Membranverschmutzung sowohl in bakteriellen Monokulturen als auch in komplexen Biofilmexperimenten zu minimieren. Die Studie bewertet zunächst verschiedene Konzentrationen von Triazol, nämlich 23 %, 49 % und 94 %, die auf den Membranen funktionalisiert wurden. Diese Membranen werden im Folgenden als PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 % und PSU-TriN-94 % bezeichnet. Zweitens wurden Palladiumionen oder Palladiumnanopartikel auf PSU-Membranen eingebettet, die mit 94 % Triazol funktionalisiert waren (dh PSU-TriN-Ionen bzw. PSU-TriN-NPs). Die Auswirkungen dieser modifizierten Membranen auf Protein- und Polysaccharidkonzentrationen sowie auf die Anzahl intakter Bakterienzellen in der anhaftenden Biofilmmatrix wurden untersucht und mit der jeweiligen Kontrolle verglichen. Darüber hinaus wurde die Änderung des Bioaktivitätsniveaus als Folge der Störung der mikrobiellen Gemeinschaft durch 16S-rRNA-Gen-basierte Amplikon-Sequenzierung der nächsten Generation charakterisiert. Ziel dieser Studie ist es, zu zeigen, dass eine sowohl mit Triazol als auch mit Pd modifizierte PSU-Membran hohe Antifouling-Eigenschaften aufweisen würde, und einen vielfältigen Ansatz für die Untersuchung bereitzustellen, wie es bei solchen modifizierten Membranen zu einer Verzögerung des Membranfoulings kommen würde.

Die Triazol-Modifikation der PSU-Membranen erhöhte die Hydrophilie der PSU-Membranen, außer wenn PSU-TriN-94 % mit den Pd-Ionen chelatisiert wurden (Tabelle 1). Die PSU-TriN-NPs-Membran zeigte im Vergleich zu allen anderen getesteten Membranen die höchste Hydrophilie (47,7°), die zwischen 58,6° und 84,3° lag. Unter allen getesteten Membranen hatte die PSU-TriN-NPs-Membran die raueste Oberflächentopographie (Ra = 58,9). Sowohl PSU-TriN-Ions- als auch PSU-TriN-NPs-Membranen hatten etwa dreifach höhere arithmetische Mittelwerte (Ra) als PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 %, PSU-TriN-94 %-Membranen und bis zu 9-fach höhere Oberflächenrauheit als PSU-Tri-0 %-Membran (Tabelle 1, Abbildung S1).

Das Lebend-Tot-Verhältnis von Mikroorganismen, die stark in der Biofilmmatrix von PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 % und PSU-TriN-94 % gebunden sind, wurde mit einem konfokalen Mikroskop untersucht (Abbildung S2). . Das Lebend-Tot-Verhältnis der Biofilmmatrix auf PSU-TriN-0 % war sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen höher als 1. Im Gegensatz dazu betrug das Verhältnis von PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 % und PSU-TriN-94 % weniger als 1 und war jeweils deutlich niedriger als PSU-TriN-0 %, das bei 1,24 Zoll lag aerob und 1,36 unter anaeroben Bedingungen (t-Test, P < 0,01) (Abb. 1A, B). In ähnlicher Weise wurde die Anzahl intakter Zellen in der Biofilmmatrix von PSU-TriN-0 % mittels Durchflusszytometrie gezählt und war sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen (t-Test, alle P < 0,05) (Abbildung S3A,B). Insbesondere waren die lebenden Zellen im Biofilm der PSU-Membranen (PSU-TriN-0 %) unter aeroben Bedingungen etwa fünfmal höher und unter anaeroben Bedingungen etwa achtmal höher als bei den übrigen drei Membranen. Darüber hinaus wies der fest gebundene Biofilm, der als Differenz zwischen Gesamtbiofilm und locker gebundenem Biofilm dargestellt wird (Abbildung S3A,B), bis zu 1,8 × 107 Zellen/(ml · cm2) und 3,95 × 108 Zellen/(ml) auf · cm2) auf PSU-TriN-0 % sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen. Die Anzahl intakter Zellen war höher als die, die auf den Membranen PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 % und PSU-TriN-94 % beobachtet wurde.

Lebend-Tot-Verhältnis von Bakterien, die auf verschiedenen Membranen haften.

(A) Verschiedene Konzentrationen von Triazol-Polysulfon-Membranen wurden unter aeroben Bedingungen getestet. (B) Vier verschiedene Konzentrationen der Triazol-Polysulfon-Membran im anaeroben Zustand. (C) PSU-TriN-94 %, PSU-TriN-Ions und PSU-TriN-NPs-Membranen wurden unter aeroben Bedingungen quantifiziert. (D) PSU-TriN-94 %, PSU-TriN-Ions und PSU-TriN-NPs-Membranen im anaeroben Zustand.

Das Lebend-Tot-Verhältnis bei PSU-TriN-NPs betrug 0,26 im aeroben Zustand und 0,52 im anaeroben Zustand, was darauf hindeutet, dass das Vorhandensein von Pd-Nanopartikeln das Lebend-Tot-Verhältnis unter aeroben (t-Test, P = 0,00) und anaeroben Bedingungen signifikant verringern kann ( t-Test, P = 0,03) im Vergleich zu PSU-TriN-94 % (Verhältnis von 0,77 und 0,86, im aeroben bzw. anaeroben Zustand) (Abb. 1C, D). Die PSU-TriN-Ions-Membran könnte im Vergleich zur PSU-TriN-94 %-Membran auch das Lebend-Tot-Verhältnis unter aeroben und anaeroben Bedingungen weiter auf 0,43 bzw. 0,48 reduzieren (t-Test, P < 0,05) (Abb. 1C,D).

Sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen produzierte P. aeruginosa PAO1 2,34 ± 0,20 μg/(ml · cm2) Gesamtpolysaccharide unter aeroben Bedingungen und 3,25 ± 0,26 μg/(ml · cm2) unter anaeroben Bedingungen innerhalb seiner Biofilmmatrix auf PSU-TriN- 0 % Membranen. Die Polysaccharidmenge auf PSU-TriN-0 % war für beide Bedingungen deutlich höher als die auf Triazol-modifizierten Membranen. (d. h. PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 %, PSU-TriN-94 %) (t-Test, alle P < 0,03) (Abb. 2A, B). Ein signifikanter Unterschied konnte auch zwischen PSU-TriN-94%- und PSU-TriN-NPs-Membranen erzielt werden (Abb. 2C, D, t-Test, P = 0,01 bzw. 0,02 unter aeroben und anaeroben Bedingungen). Es gab jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen PSU-TriN-94 %- und PSU-TriN-Ions-Membranen (t-Test, P = 0,12 bzw. 0,13 unter aeroben und anaeroben Bedingungen). Insbesondere war die geringere Polysaccharidproduktion im Monokultur-Biofilm auf die deutlich geringere Konzentration an Exopolysacchariden (einschließlich Pel-, Psl- und Alginatpolysacchariden) zurückzuführen, die von P. aeruginosa PAO117 auf den drei triazolmodifizierten Membranen produziert wurden als auf PSU-TriN-0 %-Membranen sowohl aerobe (t-Test, P < 0,03) als auch anaerobe Bedingungen (t-Test, P < 0,02) (Abbildung S4A,B). Eine weitere signifikante Verringerung der Exopolysaccharide wurde für PSU-TriN-NPs, aber nicht für PSU-TriN-Ions im Vergleich zu PSU-TriN-94 % sowohl im aeroben (t-Test, P = 0,00 bzw. 0,07) als auch im anaeroben ( t-Test, P = 0,01 bzw. 0,84) Bedingungen (Abbildung S4C,D).

Quantifizierung der Gesamtpolysaccharide im Biofilm, der an (A) unterschiedlichen Konzentrationen von Triazolmembranen im aeroben Zustand, (B) unterschiedlichen Konzentrationen von Triazolmembranen im anaeroben Zustand, (C) PSU-TriN-94 %, PSU-TriN-Ionen und PSU befestigt ist -TriN-NPs im aeroben Zustand, (D) PSU-TriN-94 %, PSU-TriN-Ions und PSU-TriN-NPs im anaeroben Zustand.

Im Gegensatz dazu reduzierten die Triazol-modifizierten Membranen die Proteinproduktion von Pseudomonas aeruginosa PAO1 unter anaeroben Bedingungen nur signifikant (t-Test, alle P < 0,05), zeigten jedoch keine signifikante Reduzierung der Proteine unter aeroben Bedingungen (Abb. 3A, B). ). Ein weiterer Vergleich von PSU-TriN-94%-Membranen mit PSU-TriN-Ions- und PSU-TriN-NPs-Membranen zeigte ebenfalls keinen signifikanten Unterschied für die Proteinexpression sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen (Abb. 3C, D).

Proteine im Biofilm, die auf PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 % und PSU-TriN-94 % im (A) aeroben und (B) anaeroben Zustand etabliert wurden. Proteine im Biofilm, etabliert auf PSU-TriN-94 %, PSU-TriN-Ions und PSU-TriN-NPs unter (C) aeroben und (D) anaeroben Bedingungen.

PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-94 % und PSU-TriN-NPs wurden weiter auf ihre Antifouling-Wirkung untersucht, indem sie an einen aeroben Membranbioreaktor (AeMBR) im Labormaßstab angeschlossen wurden, um ein gemischtes Biofilmkonsortium zu etablieren. In beiden Läufen zeigten PSU-TriN-NPs zum Zeitpunkt der Ernte einen niedrigeren TMP. Zur Veranschaulichung: Sowohl die PSU-TriN-0 %- als auch die PSU-TriN-94 %-Membranen erreichten am 29. bzw. 28. Betriebstag in Lauf 1 eine kritische Verschmutzung, nicht jedoch die PSU-TriN-NPs (Abbildung S5A). In Durchlauf 2 erreichten die PSU-TriN-NPs in ihrem TMP nur 10 kPa, was niedriger war als die der verbleibenden zwei Membranen, als die PSU-TriN-0 % am 21. Tag eine kritische Verschmutzung erreichten (Abbildung S5B). Alle drei Membranen erreichten sowohl in Lauf 1 als auch in Lauf 2 eine durchschnittliche Effizienz bei der Entfernung des chemischen Sauerstoffbedarfs (CSB) von 95 %.

Die Polysaccharidkonzentration im löslichen EPS des an PSU-TriN-NPs befestigten Biofilms betrug 48,1 ± 10,7 μg/cm2. Diese Konzentration war deutlich niedriger als die Menge auf den Membranen PSU-TriN-0 % (59,0 ± 5,4 μg/cm2) und PSU-TriN-94 % (102,3 ± 29,0 μg/cm2) in Lauf 1 (t-Test, P =). 0,05 bzw. 0,00). In Lauf 2 betrug die Polysaccharidkonzentration auf PSU-TriN-0 % 40,7 ± 12,0 μg/cm2. Im Gegensatz dazu kam es bei PSU-TriN-NPs zu einem signifikanten Rückgang auf 5,86 ± 0,48 μg/cm2 Polysaccharid (t-Test, P = 0,00) (Abb. 4A, B). Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung von Polysaccharid in den Retentat- und Permeatströmen von AeMBR, dass die Menge an Retentatpolysaccharid (11,4 μg/ml in Lauf 1 und 8,0 μg/ml in Lauf 2) höher war als die Permeatmenge (6,5 μg/ml, 6,5 μg/ml). ml, 5,6 μg/ml in Lauf 1 bzw. 5,9 μg/ml, 2,7 μg/ml, 5,2 μg/ml in Lauf 2, von PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-94 %, PSU-TriN-NPs ), was auf die Abstoßung einiger Polysaccharide durch die Membranen hinweist (Abbildung S6A,B).

Polysaccharid- und Proteinquantifizierung in löslicher extrazellulärer Polymersubstanz (EPS), angebracht an PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-94 % und PSU-TriN-NPs von Lauf 1 und Lauf 2. (A) Polysaccharid in Lauf 1, (B ) Polysaccharid in Lauf 2, (C) Protein in Lauf 1, (D) Protein in Lauf 2.

Die Konzentration des an der PSU-TriN-NPs-Membran gebundenen Proteins betrug in Lauf 1 34,14 μg/cm2 und war deutlich niedriger als bei den anderen beiden Membranen (t-Test, P = 0,00 und 0,00) (Abb. 4C). Ein ähnliches Ergebnis konnte für Lauf 2 erzielt werden. Die Konzentration des an PSU-TriN-NPs-Membranen gebundenen Proteins betrug in Lauf 2 4,40 μg/cm2 und war deutlich niedriger als bei den getesteten Membranen (t-Test, P = 0,00) (Abb. 4D). Die Proteinmessung wurde durch HPLC unter Verwendung eines 280-nm-Detektors weiter verifiziert. HPLC-Chromatogramme zeigten, dass in den Retentat- und Permeatströmen aller drei Membranen ein Einzelpeak-Proteinfragment von 0,93 kDa beobachtet wurde (Abbildung S7), allerdings in einer höheren Konzentration in Lauf 1 im Vergleich zu Lauf 2. Im Gegensatz dazu waren die Proteinfragmentprofile in der Die Biofilmmatrix der drei Membranen unterschied sich stark von der in den Retentat- und Permeatströmen beobachteten. Die Proteinfragmentprofile auf den Membranen hatten ein Molekulargewicht (MW) im Bereich von 0,15 kDa bis 661,7 ± 40,2 kDa in Durchlauf 1. Nur das 661,7 kDa MW konnte auf der PSU-TriN-0 %-Membran in Durchlauf 2 und dem restlichen Palladium nachgewiesen werden -modifizierte Membranen hatten keine nachweisbaren Fragmente (Abbildung S7).

Die durchschnittliche ATP-Konzentration in der an der PSU-TriN-NPs-Membran befestigten Biofilmmatrix betrug etwa 133,59 ± 21,4 pmol/cm2 in Lauf 1 und 116,60 ± 18,37 pmol/cm2 in Lauf 2 (Abb. 5A, B). Das Vorhandensein von Pd-Nanopartikeln auf der PSU-TriN-Membran verringerte die ATP-Konzentration sowohl in Lauf 1 als auch in Lauf 2 signifikant (t-Test, P = 0,00). Die durchschnittliche AI-2-Konzentration der PSU-TriN-0 %- und PSU-TriN-94 %-Membranen betrug 3,18 bzw. 3,88 nmol/cm2 und sank in Lauf 1 auf 0,72 nmol/cm2 auf der PSU-TriN-NPs-Membran (Abb. 5C). In Lauf 2 waren die durchschnittlichen AI-2-Konzentrationen in der PSU-TriN-0 %-Membran 6- bzw. 24-mal höher als die in PSU-TriN-94 %- bzw. PSU-TriN-NPs-Membranen nachgewiesenen Konzentrationen (Abb. 5D).

ATP- und AI-2-Messung in EPS an PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-94 und PSU-TriN-NPs.

(A) ATP-Konzentration von Lauf 1; (B) ATP-Konzentration von Lauf 2; (C) AI-2-Menge von Lauf 1; (D) AI-2-Menge von Lauf 2.

Das Vorhandensein von Triazolen mit einer Konzentration von 94 % (d. h. PSU-TriN-94 %) und Pd-Nanopartikeln (d. h. PSU-TriN-NPs) auf der PSU-TriN-0 %-Membran führte zu einer anderen mikrobiellen Gemeinschaft (Abbildung S8, ANOSIM, R = 0,889 in Lauf 1 und R = 0,815 in Lauf 2, P = 0,1). Zur Veranschaulichung: Die relative Häufigkeit nicht klassifizierter Acidobakterien Gp4, einer vorherrschenden Gruppe, die in der Biofilmmatrix nachgewiesen wurde, machte in Lauf 1 12,4 % der gesamten mikrobiellen Gemeinschaft auf PSU-TriN-NPs aus. Diese relative Häufigkeit war 35 % geringer als die auf Netzteil-TriN-0 %. In Lauf 2 war die relative Häufigkeit des gleichen nicht klassifizierten Acidobakteriums Gp4 auf PSU-TriN-NPs ebenfalls um 52 % geringer als auf PSU-TriN-0 %. Eine andere vorherrschende Gattung, Acinetobacter, wurde durch die Anwesenheit von Triazolen und NPs verringert. Die relative Häufigkeit betrug 6,2 % bei PSU-TriN-0 %, was 3,6-mal bzw. 2,4-mal höher war als bei PSU-TriN-NPs in Lauf 1 und Lauf 2. Mehrere OTUs wurden als assoziiert identifiziert mit Acidobacteria, Acinetobacter und Chitinophagaceae zeigten eine geringere relative Häufigkeit, wenn PSU-TriN-NPs-Membran verwendet wurde. Beispielsweise lag die Häufigkeit von Blastocatella fastidiosa, die mit den Acidobacteria assoziiert ist, bei PSU-TriN-0 % bei einer relativen Häufigkeit von 10,0 % und war 1,5-mal höher als bei PSU-TriN-NPs. In ähnlicher Weise verringerte sich in Durchlauf 2 die Häufigkeit an PSU-TriN-NPs im Vergleich zu PSU-TriN-0 % um das 1,9-fache (Tabelle 2). Ähnliche Ergebnisse können für andere OTUs erhalten werden, die mit Acidobacteria (z. B. Blastocatella fastidiosa), Acinetobacter (z. B. Acinetobacter guillouiae) und Chitinophagaceae (z. B. Terrimonas lutea) assoziiert sind (Tabelle 2).

Diese Studie hat systematisch gezeigt, dass die Funktionalisierung von Triazolliganden auf polymeren PSU-Membranen zu antibakteriellen Wirkungen führen kann. Die Kopplung von Palladium-Nanopartikeln an dieselbe Triazol-funktionalisierte Membran (Abbildung S9) kann die antibakterielle Wirkung weiter verstärken und das Auftreten von Membranverschmutzung verzögern, wenn sie an einen aeroben Membranbioreaktor im Labormaßstab angeschlossen wird.

Die Verwendung von Schwermetallen, im Allgemeinen jedoch Silber und Kupfer, jedoch nicht Palladium, auf Polymermembranen zur Erzielung einer antibakteriellen Wirkung wurde in früheren Studien vorgeschlagen18,19,20,21. Beispielsweise wurde berichtet, dass Ag-Nanopartikel eine hohe biozide Wirkung zeigen, wenn sie auf Vorwärtsosmosemembranen und Blockcopolymermembranen funktionalisiert werden7,8,21. Kupfernanopartikel wurden außerdem auf einer Dünnschicht-Verbundmembran funktionalisiert, um antibakterielle Wirkungen zu erzielen18. Ein ähnlicher Vorschlag wurde auch gemacht, Triazolliganden zu verwenden, um die Menge an intakten Zellen zu hemmen, die an Membranen haften. Beispielsweise führten Duong und Mitarbeiter die Verwendung von Polytriazol auf hydroxylfunktionalisierten Membranen ein und zeigten die antibakterielle und antianhaftungshemmende Wirkung solcher Membranen16. Tejero et al. zeigten auch, dass Copolymere mit Triazol-Funktionsgruppen eine hohe biozide Wirkung gegen viele Mikroorganismen (z. B. Hefe, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa) zeigten22.

Im Gegensatz zu den Studien, in denen modifizierte Membranen anhand eines Monokultur-Bakterienmodells auf ihre antibakterielle Wirkung untersucht wurden, lieferte diese Studie einen vielschichtigen Ansatz zum Verständnis der Mechanismen hinter der antibakteriellen und Antifouling-Wirkung solcher modifizierten Membranen. Erstens können Triazolliganden das Lebend-Tot-Verhältnis der an der Membran haftenden Bakterien erheblich verringern (Abb. 1). In ähnlicher Weise hemmten die Liganden auch wirksam das Wachstum von Bakterien (Abbildung S3) sowohl im locker gebundenen Teil als auch im gesamten Biofilm sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen. Dies steht im Gegensatz zur unmodifizierten PSU-TriN-0 %-Membran, die einen relativ größeren Anteil der intakten Zellen im fest gebundenen Teil des Biofilms aufwies (Abbildung S3). Dieser Befund lässt darauf schließen, dass die PSU-TriN-0 %-Membran anfälliger für Zelladhäsion durch Bakterien war, was wahrscheinlich auf die relativ höhere Hydrophobie dieser Membran im Vergleich zu mit Triazolen funktionalisierten Membranen zurückzuführen ist23 (Tabelle 1). Es gab jedoch keine signifikante Verbesserung des Ausmaßes der antibakteriellen Aktivität, die sich aus den unterschiedlichen Konzentrationen der auf den PSU-Membranen funktionalisierten Triazole ergab. Dies wird durch das Fehlen einer signifikanten Verringerung der Gesamtpolysaccharide, des Lebend-Tot-Verhältnisses und der Anzahl lebender Zellen bei steigenden Triazolkonzentrationen veranschaulicht, was darauf hindeutet, dass die Aktivität von Triazol kein begrenzender Faktor für die Erzielung einer antibakteriellen Wirkung ist. Stattdessen ist eine Kombination mit anderen Materialien, beispielsweise Palladium-Nanopartikeln, erforderlich, um die antibakterielle Wirkung weiter zu verstärken.

Die Hemmung des Zellwachstums wirkte sich anschließend auf die Produktion bakterieller Polysaccharide in der Biofilmmatrix aus (Abb. 2A, B). Polysaccharide und Proteine bilden die Hauptbestandteile der extrazellulären Polymersubstanz (EPS), die wiederum 90 % des Trockengewichts einer Biofilmmatrix ausmachen24. Die Reduzierung der Polysaccharide dürfte daher zu einer verzögerten Biofilmbildung auf der Membran führen. Allerdings war die hemmende Wirkung auf Proteine in den Experimenten mit Monokulturen und Biofilmen mit gemischten Arten nicht konsistent. PSU-TriN-NPs können die Proteinmenge in der Biofilmmatrix gemischter Spezies erheblich verringern (Abb. 4C, D), während das Vorhandensein unterschiedlicher Konzentrationen von Triazolliganden zu keiner signifikanten Verringerung der Proteinkonzentration im Vergleich zur Kontrolle führte (Abb. 3A). Auch die Zugabe von Palladium (dh Ionen, NPs) führte nicht zu einer signifikanten Verringerung der Proteinkonzentration im Biofilm der Monokulturarten (Abb. 3C, D). Da zur Etablierung des Monokultur-Biofilms LB-Brühe verwendet wurde, könnte die hohe Konzentration des Proteingehalts in diesem Medium zu Hintergrundstörungen bei der Verwendung der Lowry-Methode zur Quantifizierung des Proteingehalts in bestimmten Fällen beigetragen haben. Da die zur Quantifizierung des Proteingehalts verwendete Methode (d. h. die Lowry-Methode) nicht in der Lage ist, zwischen Proteinen zu unterscheiden, die aus toten Bakterienzellen lysiert werden, und solchen, die mit intakten Zellmembranen assoziiert sind, ist es alternativ möglich, dass der damit verbundene hohe Proteingehalt Modifizierte Membranen waren intrazelluläre Proteine, die aus toten Bakterienzellen herausgelöst wurden.

Stattdessen zeigte der Proteingehalt im AeMBR-Experiment einen signifikanten Unterschied zwischen den modifizierten Membranen und PSU-TriN-0 % (Abb. 4). Aufgrund der geringen Proteinkonzentration in SMP (Abbildung S6) kann es im Gegensatz zum Monokultur-Biofilm-Experiment zu geringeren Störungen bei der Lowry-Methode kommen. Zur Überprüfung wurde HPLC als alternative Methode zum Nachweis und zur Messung von Proteinfragmenten in der Biofilmmatrix gemischter Arten verwendet. Da der Nachweismechanismus der HPLC auf der Flüssigkeitschromatographie basiert, unterliegt sie nicht den gleichen Einschränkungen wie die Lowry-Methode. Mit dieser alternativen Methode wurde gezeigt, dass auf den modifizierten Membranen gemessene Proteinfragmente kaum nachweisbar waren (Abb. 4 und Abbildung S7), was darauf hindeutet, dass mit Triazol und Pd-NPs modifizierte Membranen die Menge an Proteinen verringern könnten.

Neben der Beeinträchtigung der Produktion von Polysacchariden und Proteinen korrelierte die Hemmung des Bakterienzellwachstums auch mit einer daraus resultierenden Abnahme der ATP- und AI-2-Konzentrationen pro Flächeneinheit, die beide als Parameter zur Angabe der Biomassemenge verwendet werden können. Beim weiteren Vergleich der Proteine in löslichem EPS, das aus dem Biofilm auf PSU-TriN-0 % extrahiert wurde, wurde beobachtet, dass sich die Molekulargewichtsverteilungen der Proteine deutlich von denen in SMP unterschieden (Abbildung S7). Dies legt nahe, dass bestimmte Proteinanteile in EPS nicht durch die direkte Absorption von Proteinen aus SMP entstanden sind, sondern vielmehr durch die bakterielle Aktivität entstanden sind. Eine solche Aktivität war in den modifizierten Membranen nicht erkennbar, was am deutlichen Fehlen nachweisbarer Proteinfragmente zu erkennen war. Die Änderung des Bioaktivitätsniveaus war wahrscheinlich auf Veränderungen in den mikrobiellen Gemeinschaften auf den modifizierten Membranen zurückzuführen, die sich von der Kontrollmembran unterscheiden (Abbildung S8). Zur Veranschaulichung: Die relative Häufigkeit nicht klassifizierter Acidobakterien, nicht klassifizierter Chitinophagaceae und Acinetobacter war in Gegenwart von Triazol und Palladium geringer. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der OTU-Wert von Terrimonas lutea in Gegenwart der modifizierten Membranen im Vergleich zur Kontrollmembran durchweg niedriger war (Tabelle 2). Frühere Studien berichteten, dass die Familie der Chitinophagaceae im Biofilm von Kupferrohren im Trinkwasserverteilungssystem reichlich vorhanden war25. Darüber hinaus wurde berichtet, dass nicht klassifizierte Chitinophagaceae, einschließlich Terrimonas rubra, an der Anlagerung an aerobe Membranen beteiligt sind und dass ihre Häufigkeit mit dem Ausmaß der Membranverschmutzung zunimmt26. In ähnlicher Weise wurde berichtet, dass die Gattungen Acinetobacter und Acidovorax mit der Biofilmbildung und der Häufigkeit von Quorum-Sensing-Signalmolekülen korrelieren27,28 (Tabelle 2). Die geringere relative Häufigkeit solcher Bakteriengruppen durch die modifizierten Membranen lässt auf eine langsamere Anreicherung und Bildung von bakteriellem Biofilm auf diesen Membranen schließen.

Insgesamt zeigte die Abnahme der Anzahl intakter Zellen (d. h. lebensfähiger Zellen), des Polysaccharid- und Proteingehalts innerhalb der an den Membranen befestigten Biofilmmatrix die antibakterielle Wirkung der modifizierten Membranen. Diese Ergebnisse erklärten den langsameren TMP-Anstieg, wenn die modifizierten Membranen mit aerobem MBR verbunden wurden, was darauf hindeutet, dass die Membranen weniger anfällig für Biofouling sind. Dies trotz der Zugabe von Pd-Ionen und Nanopartikeln zu Membranen, die zu einer raueren Oberflächentopographie führte (Abbildung S10, Tabelle 1). Es wurde zuvor gezeigt, dass Membranen mit rauerer Oberfläche anfälliger für Verschmutzung sind, da Rauheit die Wahrscheinlichkeit einer Zell-Oberflächen-Interaktion erhöhen und die Adhäsion von Bakterien verbessern kann23,29. Unabhängig davon deuten unsere Beobachtungen darauf hin, dass Pd-Nanopartikel und in geringerem Maße Pd-Ionen eine antibakterielle Wirkung hatten, da die Anwesenheit von Pd in Kombination mit Triazol nicht nur den Einfluss einer raueren Topographie ausgleicht, sondern auch die Antifouling-Wirkung verstärkt.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Ergebnisse dieser Studie zeigten, dass die 1,2,3-Triazol-Modifikation das Bakterienwachstum hemmen und die Menge an Polysacchariden und Proteinen verringern kann. Die mit Pd-Nanopartikeln eingebettete Triazolmembran zeigte eine synergistische Wirkung hinsichtlich ihrer antibakteriellen Wirkung. Bei Anschluss an einen aeroben Membranbioreaktor konnten die modifizierten Membranen den Transmembrandruck senken und den Biofouling-Prozess der Membran verzögern.

In dieser Studie wurden sechs Arten von PSU-Membranen bewertet. Dazu gehörten vier verschiedene Konzentrationen von Triazol (dh 0 %, 23 %, 49 % und 94 %), die auf PSU-Membranen funktionalisiert waren und als PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-23 %, PSU-TriN-49 % bezeichnet wurden. , PSU-TriN-94 % in dieser Studie. Aufgrund der Tatsache, dass nur PSU-TriN-94 %-Membranen die Pd-Ionen und Nanopartikel einbetten können, wurden PSU-TriN-94 %-Membranen verwendet, die entweder Palladiumionen (PSU-TriN-Ionen) oder Palladium-Nanopartikel (PSU-TriN-NPs) enthielten in dieser Studie ausgewertet. PSU-TriN mit unterschiedlichen Triazolkonzentrationen wurde auf der Grundlage einer veröffentlichten Methode30 synthetisiert. Kurz gesagt, Polysulfon wurde in Gegenwart von Phenylringen chlormethyliert und 1,4-disubstituierte 1,2,3-Triazolringe wurden durch Kupfer(I)-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition eingebaut. PSU-TriN-0%-, PSU-TriN-23%-, PSU-TriN-49%- und PSU-TriN-94%-Membranen wurden durch nicht lösungsmittelinduzierte Phasentrennung (d. h. Wasser) und 20 Gew.-%ige Polymerlösungen in N hergestellt. N-Dimethylacetamid (DMAc). Bei allen Synthesen wurden Polymerlösungsfilme mit einer Dicke von bis zu 200 μm über den Polyestervliesträger gegossen. PSU-TriN-Ions- und PSU-TriN-NPs-Membranen wurden durch komplexierungsinduzierte Phasentrennung31 unter Verwendung von Pd(II)-Acetat (Pd(OAc)2) als Palladiumquelle hergestellt. Kurz gesagt wurde ein 200 μm dicker Film aus Polymerlösung (20 Gew.-% PSU-TrN-94 % in DMAc) über einen Vliesträger gegossen; und der resultierende Polymerlösungsfilm wurde 3 s lang in eine 36 mM Lösung von Pd(OAc)2 in DMAc eingetaucht, um die palladiumreiche Deckschicht zu bilden. Abschließend wurde das Polymer in ein Wasserbad getaucht, um den palladiumfreien porösen Träger zu bilden. Zu diesem Zeitpunkt wurde die PSU-TriN-Ions-Membran erhalten. Ein zusätzlicher Reduktionsschritt wurde durchgeführt, um die Palladiumionen zu Nanopartikeln zu reduzieren. Dieser Schritt bestand darin, PSU-TriN-Ions 5 Minuten lang in eine 0,05 M Lösung von Natriumtetrahydroborat (NaBH4) einzutauchen und so eine PSU-TriN-NPs-Membran zu erhalten. Bisher wurde festgestellt, dass auf diese Weise synthetisierte PSU-TriN-NPs-Membranen nur auf der oberen Schicht der Polymermembran, wo sich die Vorläufer (dh Triazol) befinden, gut verteilt sind32. Die gleichmäßige Schicht aus Pd-Nanopartikeln auf der Membranoberfläche von PSU-TriN-NPs, jedoch nicht auf den PSU-TriN-Ions-Membranen, ist in den Abbildungen S10 und S11 weiter dargestellt. Alle Membranen wurden vor der Verwendung in sterilem entionisiertem Wasser aufbewahrt.

Das FEI Nova Nano Rasterelektronenmikroskop (SEM) und das Dunkelfeld-Titan 80–300 CT-Transmissionselektronenmikroskop (TEM) (Oregon, USA) wurden verwendet, um die Oberfläche von Membranen bei 5 kV bzw. 300 kV zu beobachten. Das TEM-Mikroskop war außerdem mit einem Röntgenenergiedispersionsspektroskopie-Detektor (EDS), einer ladungsgekoppelten Kamera und einem Nachsäulen-Energiefilter ausgestattet. Um die Probe für die REM vorzubereiten, wurde ein Stück Membranprobe an der Luft getrocknet und dann auf einem flachen Aluminiumstummel fixiert. 3 nm dickes Iridium wurde mit einem Sputterbeschichter K575X Emitech (Quorum Technologies, UK) auf die Membranoberfläche gesputtert. Um die Probe für die TEM vorzubereiten, wurden die Membranen in niedrigviskoses Epoxidharz (Agar R1165) eingebettet und 24 Stunden bei 60 °C ausgehärtet. Ultradünne Schnitte (100 nm) wurden mit einem Ultramikrotom (Leica EM UC6) hergestellt und auf ein Kupfergitter (180 Mesh) gelegt. Zur Charakterisierung der Membranoberflächentopographie wurde Rasterkraftmikroskopie (AFM) eingesetzt. Die luftgetrocknete Membran wurde auf einem Glasobjektträger fixiert. Die AFM-Bildgebung wurde mit Bruker Dimension ICON-Geräten (Santa Barbara, CA, USA) im Soft-Tap-Modus durchgeführt. Für jede Membran wurde ein Bild mit 5 μm Breite und 5 μm Länge gescannt. Der Kontaktwinkel wurde zur Quantifizierung der Hydrophilie von Membranen mit dem EasyDrop-Formanalysator (Krüss, Hamburg, Deutschland) im statischen Modus bei Umgebungstemperatur gemessen. Als Prüfflüssigkeit wurde hochreines Wasser verwendet und die Mittelwerte aus drei verschiedenen unabhängigen Proben ermittelt.

Der Drip-Flow-Biofilmreaktor (DFR) (Biosurface Technologies, Bozeman, MT, USA) wurde verwendet, um einen Monokultur-Biofilm auf den Membranen zu etablieren. Die Methoden und Bedingungen waren wie zuvor beschrieben33,34. Kurz gesagt, P. aeruginosa PAO1 wurde in 20 ml LB-Brühe (Lennox) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) inokuliert und die Wachstumskultur wurde in einem Schüttelinkubator mit 200 U/min 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Danach wurde die Bakterienkultur mit LB-Brühe auf eine optische Dichte (OD600) von 0,07 bei 600 nm verdünnt. Diese OD-Messung bei einer Wellenlänge von 600 nm entspricht einer ungefähren Zelldichte von 108 Zellen/ml. Die Membranen wurden auf Polycarbonat-Coupons befestigt und in Duplikaten getestet. Die Coupons wurden dann in einzelne Kanäle aus autoklaviertem DFR gegeben und 10 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Für anaerobe Bedingungen wurde der LB-Brühe 1 % Kaliumnitrat w/v zugesetzt, um das Wachstum von P. aeruginosa PAO1 in Gegenwart von Nitrat als alternativem Elektronenakzeptor sicherzustellen35. Die Membranen wurden nach 48-stündiger Kultivierung in Gegenwart eines kontinuierlichen Flusses von 0,8 ml/min LB-Brühe unter aeroben Bedingungen und nach 72-stündiger Kultivierung aufgrund einer langsameren Wachstumsrate unter anaeroben Bedingungen geerntet. Es wurden zwei Läufe mit dem DFR unter aeroben und zwei Läufe unter anaeroben Bedingungen durchgeführt.

In dieser Studie wurde auch ein Upflow-Attached (UA) AeMBR mit den gleichen Betriebsbedingungen wie zuvor beschrieben26 verwendet, um ein gemischtes Bakterienkonsortium auf den Membranen zu etablieren. Drei externe Querstrom-Flachmembranmodule (d. h. PSU-TriN-0 %, PSU-TriN-94 %, PSU-TriN-NPs) wurden in Reihe mit dem Reaktor verbunden. Jede Membran wurde mit einem konstanten Transmembranfluss von 6 bis 8 LM−2 h−1 (LMH) bei einer durchschnittlichen hydraulischen Retentionszeit (HRT) von 18,5 Stunden betrieben. Alle Membranen wurden gleichzeitig geerntet, wenn eine der drei Membranen kritische Verschmutzungen aufwies. Lösliche mikrobielle Produkte (SMP), einschließlich Permeat von jeder Membran und Retentat im Reaktor, wurden während des gesamten Betriebs wöchentlich auf der Grundlage des zuvor beschriebenen Protokolls beprobt26. Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse sicherzustellen, wurden zwei Läufe mit dem AeMBR durchgeführt.

Für die DFR-Experimente wurden die doppelten Membranen in jedem Lauf geerntet und auf leicht unterschiedliche Weise gehandhabt. Kurz gesagt wurde eine Membran mit 40 ml 1X PBS gewaschen, um den lose gebundenen Biofilm zu entfernen, und die Membran wurde anschließend für die konfokale mikroskopische Analyse aufbewahrt; und die andere Membran wurde ohne vorherigen Waschschritt in 40 ml PBS gegeben (dh es wurden sowohl lockerer als auch stark gebundener Biofilm gesammelt). Die Röhrchen, die den lose gebundenen Biofilm und den gesamten Biofilm enthielten, wurden einzeln 3 Minuten lang mit einem Q500-Ultraschallgerät (Qsonica, Newton, CT, USA) bei 25 % Amplitude und 2 s Pulsationsintervallen mit Ultraschall beschallt, um den Biofilm in der flüssigen Suspension zu verteilen. Anschließend wurden die Membranen aus der flüssigen Suspension entfernt. Ein Teil der Suspension wurde für die Zählung lebender Zellen und Pel-Polysaccharid verwendet, während der Rest zur Polysaccharid- und Proteincharakterisierung durch eine 0,22 μm Celluloseacetatmembran filtriert wurde.

Für die AeMBR-Experimente wurde jede geerntete Membran mit einer Fläche von 20 cm x 2,5 cm aseptisch in drei gleiche Teile geschnitten. Jeder Abschnitt wurde entsprechend der Richtung des Abwasserflusses als Einlass, Mitte und Auslass bezeichnet. Jeder Teil wurde zur ATP-Quantifizierung und zur Messung löslicher EPS weiter unterteilt. Zur Vorbereitung der löslichen EPS-Messungen wurde jede Membranunterportion jeweils in 6 ml 1X PBS eingetaucht. Die Membranen wurden auf ähnliche Weise wie zuvor beschrieben mit Ultraschall behandelt. Anschließend wurden die Membranen entfernt und die verbleibenden Suspensionen 20 Minuten lang bei 9400 g zentrifugiert, bevor sie durch 0,22 μm Celluloseacetat filtriert wurden. Die nach der Zentrifugation erhaltenen Zellpellets wurden zur DNA-Extraktion und zur Analyse der mikrobiellen Gemeinschaft gelagert.

Zwei Methoden wurden verwendet, um lebende Zellen innerhalb des auf den PSU-Membranen aufgebauten Monokultur-Biofilms zu zählen. Zunächst wurde 1 ml der flüssigen Suspension aliquotiert und in 1X PBS für die Durchflusszytometrie auf Accuri C6 (BD Bioscience, NJ, USA) um das 5000- bis 7000-fache verdünnt. Zum Färben der Bakterien wurde das LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability and Counting Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, 300 μl des 2X Propidiumiodid: Syto9-Farbstoffs mit jeweiligen Konzentrationen von 30 μM und 6 μM wurden zu 300 μl verdünnter flüssiger Suspension gegeben und vor der Durchflusszytometrie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und im Dunkeln inkubiert. 50 μl gefärbte Proben wurden mit einer Rate von 35 μl/min injiziert, um Zellen mit intakten Zellwänden (d. h. lebende Zellen) zu zählen. Zweitens wurden die Membranen mit dem stark gebundenen Biofilm 20 Minuten lang mit dem LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability and Counting Kit gefärbt. Es wurde ein Zeiss LSM 710 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Deutschland) mit 20-fachem Vergrößerungsobjektiv verwendet. Das Bildscannen wurde mit der 488-nm- und 561-nm-Laserlinie eines Ar/Kr-Lasers durchgeführt. Es wurden 7 verschiedene Bilder für jede Membran aufgenommen und die Bilder wurden mit der Image J-Software36 analysiert. Während der Analyse wurde jedes Bild entsprechend den roten und grünen Kanälen toter bzw. lebender Zellen in zwei Bilder aufgeteilt. Anschließend wurden die toten und lebenden Zellen einzeln gezählt, um das Verhältnis Lebend/Tot zu bestimmen.

Pseudomonas aeruginosa PAO1 ist in der Lage, Pel-, Psl- und Alginat-Exopolysaccharide zu produzieren17. Diese Exopolysaccharide sind wichtig für die Bereitstellung des Strukturgerüsts des Biofilms von P. aeruginosa37 und es wird angenommen, dass sie die vorherrschenden Polysaccharide innerhalb der Monokultur-Biofilmmatrix sind. Die Polysaccharide wurden durch Kongofärbung basierend auf der vorherigen Beschreibung mit einer leichten Modifikation gemessen. Kurz gesagt, vor der Analyse wurde die flüssige Suspension kurz verwirbelt, um die Homogenität des Inhalts sicherzustellen. 10 ml der homogenen Suspension wurden 10 Minuten lang bei 9400 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde in 10 ml 40 mg/ml Kongorot-LB-Brühe resuspendiert und 90 Minuten lang in einem Schüttelinkubator bei 37 °C inkubiert. Danach wurde die Suspension erneut 10 Minuten lang bei 9400 g zentrifugiert und der Überstand auf seine OD490 gemessen. Das gesamte im Überstand absorbierte Kongorot wurde gemessen. LB-Brühe mit 5 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml und 80 mg/ml Kongorot wurde ebenfalls von OD490 getestet, um eine Standardkurve zur Berechnung der Kongokonzentration im Überstand zu erstellen.

Der Überstand wurde vor der Bestimmung von PN und PS zunächst durch einen 0,22-μm-Spritzenfilter (VWR US, Radnor, PA, USA) filtriert. PN wurde mit dem Total Protein Kit, Micro Lowry, Peterson's Modification (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) basierend auf der Lowry-Methode38 mit 0 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 40 μg quantifiziert /ml und 80 μg/ml Rinderserumalbumin (BSA) als Standard und dreifach gemessen. BSA stammt ursprünglich aus Neuseeland und wurde von Sigma-Aldrich in lyophilisiertem Pulver unter der CAS-Nummer 9048-46-8 kommerziell erhältlich gemacht. PS wurde nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Als Standards wurden 0 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 40 μg/ml und 80 μg/ml Glucose verwendet39. Die Molekulargewichtsanalyse (MW) von Proteinen in SMP und EPS wurde auf einem Water BreezeTM 2 HPLC-System (Waters Chromatography, Milford, MA, USA) basierend auf den von Xiong et al.26 beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Adenosintriphosphat (ATP) und Autoinducer-2 (AI-2) wurden quantifiziert, um die Menge an Biomasse auf den Membranen zu messen. Die Membran mit den Abmessungen 1 cm x 2,5 cm wurde in 2 ml entionisiertes Wasser gegeben und 2 Minuten lang mit 25 % Amplitude und 2 s langen Pulsationsintervallen mit Ultraschall behandelt. Der ATP-Gehalt in der Suspension wurde mit dem Celsis Amplified ATP TM Reagenzienkit auf einem Advance-Luminometer (Celsis, Westminster, London, UK) mit entionisiertem Wasser als Negativkontrolle quantifiziert. Alle Proben wurden dreifach gemessen. Der AI-2 aus der flüssigen Suspension der geernteten Membranen wurde auf der Grundlage eines früheren Protokolls26 bestimmt.

Die genomische DNA der Pellets, die aus der löslichen EPS-Extraktion gewonnen wurden, wurde mit geringfügigen Modifikationen mit dem UltraClean® Soil DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories, Carlsbad, USA) extrahiert40. Die PCR-Amplifikation der 16S-rRNA-Gene wurde mit 515F (5′-Illumina-Überhang-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′) und 907R (5′-Illumina-Überhang-CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′) durchgeführt. Alle Amplikons hatten die erwartete Größe von etwa 550 bp und die Negativkontrolle weist keine Amplifikation auf. PCR-Amplikons wurden mit AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter, CA, USA) gereinigt. Anschließend wurde eine Index-PCR durchgeführt, um die vom Nextera XT Index Kit (Illumina Inc, San Diego, CA, USA) bereitgestellten Dual-Indizes basierend auf dem Protokoll des Herstellers anzuhängen. Indizierte PCR-Amplikons wurden mit AMPure XP-Perlen (Beckman Coulter, CA, USA) gereinigt. Äquimolare Konzentrationen der Proben wurden gemischt und zur Illumina MiSeq-Sequenzierung an das KAUST Core-Labor übermittelt. Die Sequenzierungsdaten wurden hinsichtlich ihrer Qualität verarbeitet und mit demselben Ansatz analysiert, der in der vorherigen Studie angegeben wurde41.

Der Grad der Ähnlichkeit der an den drei Arten von Membranen befestigten mikrobiellen Gemeinschaften wurde mit Primer E Version 742 analysiert. Kurz gesagt wurden die Häufigkeiten der Bakterien- und Archaeen-Gattungen in Primer E Version 7 eingegeben und vor der Berechnung ihres Brays einer Quadratwurzeltransformation unterzogen -Curtis-Ähnlichkeiten. Die Bray-Curtis-Ähnlichkeitsmatrix wurde dann verwendet, um durch multivariate Analyse ein Diagramm mit nichtmetrischer mehrdimensionaler Schwellenwertskalierung (nMDS) zu erstellen. Bakterielle Ziele, die eine Korrelation von >0,7 mit den multivariaten Mustern auf dem nMDS aufwiesen, wurden als Vektoren überlagert. Mithilfe der ANOSIM-Analyse wurde ermittelt, ob sich die beobachteten Cluster auf nMDS signifikant unterschieden. Alle anderen Signifikanztests wurden mit einem zweiseitigen t-Test auf Microsoft Excel 2013 und Prism 6 analysiert.

Alle Hochdurchsatz-Sequenzierungsdateien wurden im Short Read Archive (SRA) des European Nucleotide Archive (ENA) unter der Studienzugangsnummer PRJEB12586 hinterlegt.

Alle Versuchsprotokolle wurden gemäß den genehmigten Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Biosafety and Bioethics Committee, KAUST, genehmigt.

Zitierweise für diesen Artikel: Cheng, H. et al. Antibiofilm-Effekt verstärkt durch Modifikation von 1,2,3-Triazol- und Palladium-Nanopartikeln auf Polysulfonmembranen. Wissenschaft. Rep. 6, 24289; doi: 10.1038/srep24289 (2016).

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Die Autoren danken Moustapha Harb und Dr. Yanghui Xiong für die technische Unterstützung und Anleitung. Die Autoren danken Dr. Manuel A. Roldan vom KAUST Imaging and Characterization Core Lab für die technische Unterstützung bei der Erfassung der STEM-EDX-Bilder. Diese Studie wird durch die KAUST CCF-Finanzierung FCC/1/1971-06-01 unterstützt, die P.-Y. Hong.

Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Chongqing, 401122, China

Hong Cheng & Liyan Song

Abteilung für Bio- und Umweltwissenschaften und -technik (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), Water Desalination and Reuse Center (WDRC), Thuwal, 23955-6900, Saudi-Arabien

Hong Cheng und Pei-Ying Hong

Abteilung für Bio- und Umweltwissenschaften und -technik (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), Thuwal, 23955-6900, Saudi-Arabien

Yihui Xie & Suzana Nunes

Abteilung für Physikalische Wissenschaften und Ingenieurwesen (PSE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), Advanced Membrane and Porous Materials (AMPM), Thuwal, 23955-6900, Saudi-Arabien

Luis Francisco Villalobos & Klaus-Viktor Peinemann

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HC und PYH konzipierten und gestalteten die Experimente; YX und LFV stellten die Membranen her und führten eine mikroskopische Charakterisierung der Membranen durch; HC führte die Probenahmen und Experimente durch; HC und PYH analysierten die Daten; PYH, LS, KVP und SN stellten Reagenzien/Materialien/Analysewerkzeuge/Arbeitskräfte zur Verfügung; HC und PYH trugen zum Schreiben des Manuskripts und zur Erstellung der Abbildungen bei. Alle Autoren haben diesen Beitrag gelesen und genehmigt.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Cheng, H., Xie, Y., Villalobos, L. et al. Antibiofilm-Effekt verstärkt durch Modifikation von 1,2,3-Triazol- und Palladium-Nanopartikeln auf Polysulfonmembranen. Sci Rep 6, 24289 (2016). https://doi.org/10.1038/srep24289

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Eingegangen: 24. Februar 2016

Angenommen: 24. März 2016

Veröffentlicht: 12. April 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep24289

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Angewandte Mikrobiologie und Biotechnologie (2017)

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