Regionen des Hepatitis-C-Virus E2, die für die Membranassoziation erforderlich sind

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 433 (2023) Diesen Artikel zitieren

1637 Zugriffe

1 Zitate

10 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Das Hepatitis-C-Virus (HCV) nutzt einen hybriden Eintrittsmechanismus. Aktuelle Strukturdaten deuten darauf hin, dass bei Einwirkung von niedrigem pH-Wert und Cluster of Differentiation 81 (CD81) der Aminoterminus des Hüll-Glykoproteins E2 geordnet wird und eine interne Schleife mit zwei invarianten aromatischen Resten in die Wirtsmembran freisetzt. Hier präsentieren wir die Struktur eines Amino-terminal verkürzten E2 mit der Membranbindungsschleife in einer gebogenen Konformation und den sequestrierten aromatischen Seitenketten. Ein Vergleich mit drei zuvor beschriebenen E2-Strukturen mit demselben Fab zeigt, dass diese interne Schleife flexibel ist und dass der lokale Kontext die Freilegung hydrophober Reste beeinflusst. Biochemische Tests zeigen, dass dem Amino-terminal verkürzten E2 die grundlegende Membranbindungskapazität der E2-Ektodomäne fehlt. Somit ist die Amino-terminale Region eine entscheidende Determinante sowohl für CD81 als auch für die Membraninteraktion. Diese Ergebnisse liefern neue Einblicke in den HCV-Eintrittsmechanismus.

Hepatitis C virus (HCV) is a leading cause of chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma with significant morbidity and mortality rates in humans1. The World Health Organization estimates that there are 1.5 million new HCV infections each year and 58 million people worldwide are chronically infected (2021)." href="/articles/s41467-023-36183-y#ref-CR2" id="ref-link-section-d85794354e485">2. In the United States, annual acute HCV infections increased by 387% from 2010 to 2019 in association with rising addiction to intravenously administered opioids (2019)." href="/articles/s41467-023-36183-y#ref-CR3" id="ref-link-section-d85794354e489"> 3. Die kürzlich zugelassenen direkt wirkenden antiviralen Medikamente sind hochwirksam gegen alle Genotypen von HCV4, aber sobald sie geheilt sind, kann eine Person erneut infiziert werden. Im Zusammenhang mit Sucht und intravenösem Drogenkonsum ist ein dauerhafter Schutz vor einer HCV-Infektion ein ungedeckter medizinischer Bedarf.

Differenzierungscluster 81 (CD81)5, Scavenger-Rezeptor Klasse B Typ I (SR-BI)6, Claudin-1 (CLDN)7 und Occludin (OCLN)8 sind zelluläre Faktoren, die für den HCV-Eintritt notwendig sind. Die Blockierung der HCV-Bindung an CD81 ist das wichtigste Mittel zur Antikörper-vermittelten Neutralisierung9. CD81 wird allgegenwärtig auf einer Vielzahl von Zelllinien exprimiert, was darauf hindeutet, dass es eine sekundäre Rolle bei der Hepatozyten-spezifischen Rezeptorbindung spielt10,11. CD81 ist ein integrales Membranprotein mit vier Transmembranhelices und zwei extrazellulären Schleifen, die als kleine und große extrazelluläre Schleife (SEL bzw. LEL) bezeichnet werden. Eine Behandlung mit niedrigem pH-Wert inaktiviert HCV12 nicht. Die Inkubation mit CD81-LEL und einem niedrigen pH-Wert führt zu einer Konformationsänderung des HCV, die die Fähigkeit des Virus, in permissive Zellen einzudringen, irreversibel verringert13. Eine Vorbehandlung entweder mit einem Puffer mit niedrigem pH-Wert oder mit CD81-LEL erhöht die HCV-Infektiosität, was darauf hindeutet, dass jede dieser Bedingungen einen notwendigen Vorbereitungsschritt darstellt13.

Während die HCV-Hüllglycoproteine 1 und 2 (E1 und E2) die Rezeptorbindung und den Rezeptoreintritt vermitteln, interagiert E2 spezifisch mit CD81 und SR-BI5,6. E2 ist ein Typ-I-Membranprotein mit einem Amino-(N)-terminalen, löslichen Glykoprotein und einer Carboxy-(C)-terminalen Transmembranhelix (TM) (Abb. 1a). Beachten Sie, dass die Nummerierung auf der hier untersuchten J6-Sequenz (Genotyp 2a) basiert und je nach Genotyp leicht variiert. Der zentrale E2core ist eine kugelförmige, gefaltete Domäne, die ein Disulfid-stabilisiertes Immunglobulin-Sandwich umfasst, das von der hypervariablen Region 1 (HVR1), der Antigenstelle (AS) 412, der Vorderschicht und HVR2 am N-Terminus und einer Stammregion am N-Terminus flankiert wird C-Terminus14 (Abb. 1a). Die Gesamtarchitektur des E2core (Reste 460–646) umfasst eine zentrale Immunoglobin-β-Sandwich-Innenschicht (Reste 485–519), gefolgt von einer CD81-Bindungsschleife (Reste 520–539) und einer kurzen β-Sandwich-Schicht (Reste 540). –570). Der E2core behält die gesamte E2-Architektur der Ektodomäne bei, ist jedoch nicht in der Lage, an CD8115 zu binden.

a Schematische Darstellung von E2 in voller Länge (Isolat J6, Genotyp 2a) und verschiedenen Fragmenten, die in Struktur- und Funktionsstudien verwendet werden. b Röntgenkristallstruktur von E2core+Stamm (PDB-ID: 8DK6). Das endgültige Modell besteht aus den Resten 491–571 und 596–653 von E2core+Stamm (c). Die E2core-Struktur (PDB-ID: 4WEB) besteht aus den Resten 488–522, 538–571 und 596–649. d Die eE2-Struktur (PDB-ID: 7MWW) besteht aus den Resten 422–453, 490–571 und 596–650, und e die ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL (PDB-ID: 7MWX) besteht aus den Resten 418–453, 490– 571 und 597–650. Jede Struktur (b–e) wurde in Gegenwart des nicht neutralisierenden 2A12-Fab-Antikörpers (nicht gezeigt) bestimmt. Die schweren und leichten Kettenreste von Fab 2A12 bestehen aus den Resten 1–219 bzw. 1–218. Die Region der CD81-Bindungsschleife (520–539) ist entsprechend einem für E2core+Stamm, E2core, eE2, ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL und der vorderen Schicht mit Rot, Cyan, Blau, Grün bzw. Weizen farbcodiert. Tyr529-, Trp531-Reste an der Spitze der CD81-Bindungsschleife und Ile422 der vorderen Schicht sind ebenfalls hervorgehoben. Ungeordnete Regionen werden durch eine gestrichelte Linie dargestellt. Die E2-Orientierung in b–e ist ungefähr gleich. Die Restnummerierung für jede Kette, die in den endgültigen Strukturmodellen erstellt wurde, ist angegeben.

Kürzlich wurde über die Strukturen von E2 in Gegenwart und Abwesenheit des nichtproduktiven Wirts-Tamarins CD81-LEL (tCD81-LEL) bei niedrigem pH-Wert berichtet16. In Abwesenheit von CD81 verfügt die Ektodomäne von E2 (eE2) über eine interne Schleife (die CD81-Bindungsschleife), die an Ile422 der Vorderschicht angelegt ist. Bei der Bindung an CD81 bei niedrigem pH-Wert erfährt eE2 zwei Konformationsänderungen: Die vordere Schicht interagiert mit CD81, indem sie AS412 um CD81 faltet, und die CD81-Bindungsschleife erstreckt sich vom Kern weg. Die CD81-Bindungsschleife weist an der Spitze der Schleife zwei invariante hydrophobe Reste (Tyr529 und Trp531) auf, die für die Interaktion mit der Wirtsmembran von entscheidender Bedeutung sind16.

Hier charakterisieren wir die Rolle der Vorderschicht und des Stammes bei CD81-LEL und der Membranbindung. Größenausschlusschromatographie und ein Liposomen-Flotationsassay zeigten, dass die E2-Frontschicht eine kritische Region sowohl für CD81-LEL als auch für die Membraninteraktion ist. Die Röntgenkristallstruktur des E2core+Stamms, dem die HVR1-, AS412-, Frontschicht- und TM-Regionen fehlen (Abb. 1a), in Gegenwart eines nicht neutralisierenden Antikörpers, 2A12, wurde bestimmt. In der Struktur ist die Stammregion ungeordnet, während die CD81-Bindungsschleife eine gebogene Konformation aufweist, wodurch die Tyr529- und Trp531-Reste in der Mitte der Schleife gebunden sind. Die Verlängerung der CD81-Bindungsschleife ist möglicherweise nuancierter als bisher angenommen und ihre Flexibilität spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle beim Eintritt und der Fusion von Viren.

Bei allen früheren HCV-E2-Strukturen, die durch Röntgenkristallographie bestimmt wurden, wurden die Stammregionen (646–712) und die TM-Ankerregionen (713–746) weggelassen, um die Proteinlöslichkeit und Stabilität für die Kristallbildung zu erhöhen15,16,17,18,19,20. Um die strukturelle Rolle der Stammregion zu verstehen, wurden Kristallisationsversuche an verschiedenen E2-Fragmenten in Gegenwart und Abwesenheit des 2A12-Fab durchgeführt. Kristalle des an 2A12 Fab gebundenen E2core+Stamm-Fragments (456–713) wurden mit einer Auflösung von ~2,5 Å bestimmt (Tabelle 1). Das endgültige Modell besteht aus den Resten 491–571 und 596–653 von E2core+Stamm sowie den Resten der schweren Kette 1–219 und den Resten der leichten Kette 1–218 von 2A12 Fab. Die Ausrichtung der E2core+Stammstruktur mit E2core, eE2 und dem ∆HVR1 eE2/tCD81-LEL-Komplex ergab eine quadratische Abweichung (RMSD) von 0,49 Å, 0,46 Å bzw. 0,80 Å für ähnliche Kohlenstoff-Alpha-Positionen (Abb. 1)15,16. Die E2core+Stammstruktur wies für den größten Teil der Stammregion (Reste 653–713) keine interpretierbare Dichte auf. In der aktuellen E1E2-Struktur befindet sich die Stammregion im Komplex mit E1, was darauf hindeutet, dass die Faltung dieser Region möglicherweise E1-abhängig ist21. Die E2core+Stamm-Struktur zeigt eine kontinuierliche Elektronendichte für die CD81-Bindungsschleife (Reste 520–539) (Ergänzende Abbildung 2), die sich von zuvor berichteten Strukturen (Abb. 1) unterscheidet und durch Kristallpackung stabilisiert wird (Abb. 2). .

a Die asymmetrische Einheit des E2core+Stamm/2A12-Fab-Komplexes ist dargestellt. b Die Kristallpackung des E2core+Stamm/2A12-Fab-Komplexes hebt eine Symmetrieverbindung um eine zweifache Rotationsachse in der Seite hervor (schwarze Ellipse). Die CD81-Bindungsschleife (rot) ist gegen einen Symmetriepartner gepackt und hält die Schleife in der gebogenen Konformation. HC und LC bezogen sich auf die schwere bzw. leichte Kette von 2A12 Fab.

Die E2core+Stamm-Struktur stellt die vierte Struktur eines E2-Fragments aus dem HCV-Isolat J6 dar, das an das Kristallisations-Chaperon 2A12 Fab15,16 gebunden ist (Abb. 1). Infolgedessen enthüllt der Vergleich von Strukturen unterschiedlicher E2-Längen desselben Genotyps in Gegenwart oder Abwesenheit von tCD81-LEL wichtige mechanistische Details. Der Hauptstrukturunterschied zwischen den vier E2-Strukturen ist die Ausrichtung der CD81-Bindungsschleife (Abb. 1b – e). Durch das Entfernen der CD81-Bindungsschleife aus der Überlagerungsberechnung wurde der RMSD für ähnliche Kohlenstoff-Alpha-Atome auf weniger als 0,3 Å gesenkt; Daher hat das Vorhandensein der Vorderschicht, HVR1 und des Stammes keinen Einfluss auf die kugelförmige Falte der E2-Kernregion. Die CD81-Bindungsschleife in der E2core+Stamm-Struktur ist zur hinteren Schicht von E2 hin gebogen (Abb. 1b und 3a).

a Gebogen (E2core+Stamm, PDB-ID: 8DK6), b eingefahren (eE2) (PDB-ID: 7MWW) und c verlängert (ΔHVR1 eE2) (PDB-ID: 7MWX) in drei verschiedenen Ausrichtungen. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind Y529, W531 und I422 hervorgehoben und c-gebundenes tCD81-LEL wird nicht angezeigt.

Um das Ausmaß der Bewegung der CD81-Bindungsschleife besser zu verstehen, wurde die Schleife mit der entsprechenden Region der anderen E2-Strukturen verglichen. Die Löschung von HVR1, AS412 und der vorderen Schicht in der E2core-Struktur (PDB-ID 4WEB) führte zu einer Störung der CD81-Bindungsschleife (Abb. 1c)15. In der eE2-Struktur ohne CD81 richtet die vordere Schicht und insbesondere der Rest Ile422 die CD81-Bindungsschleife in der zurückgezogenen Position aus (Abb. 1d und 3b). In Gegenwart eines niedrigen pH-Werts und von tCD81-LEL wird die AS412-Region von ΔHVR1 eE2 geordnet und der Rest Ile422 bewegt sich um ca. 9 Å, was mit einer erweiterten CD81-Bindungsschleife zusammenfällt (Abb. 1e und 3c). Der Abstand zwischen den CD81-bindenden Schleifenresten Tyr529 oder Trp531 in E2core+Stamm (gebogen) und eE2, das die vordere Schicht enthält, in Abwesenheit von CD81-LEL (zurückgezogen) beträgt ~17 Å bzw. ~19 Å (Abb . 4a). Der Vergleich der verlängerten CD81-Bindungsschleife von ΔHVR1 eE2 aus dem Komplex mit tCD81-LEL mit dem gebogenen E2core + -Stamm zeigte eine Distanzbewegung von ~30 Å bzw. ~22 Å von Tyr529 bzw. Trp531 (Abb. 4b). Darüber hinaus ist die Ausrichtung der Schleife relativ zu CD81 in die entgegengesetzte Richtung gebogen. Als Referenz wird die Bewegung der CD81-Bindungsschleife in Abwesenheit und Anwesenheit von tCD81-LEL angegeben (Abb. 4c).

Die Überlagerung a der gebogenen CD81-Bindungsschleife von E2core+Stamm (rot) mit der zurückgezogenen CD81-Bindungsschleife von eE2 (blau), b der verlängerten CD81-Bindungsschleife von ΔHVR1 eE2 (grün) und der gebogenen CD81-Bindungsschleife von E2core+Stamm (rot) und c die verlängerte CD81-Bindungsschleife von ΔHVR1 eE2 (grün) und die zurückgezogene CD81-Bindungsschleife von eE2 (blau). b, c tCD81-LEL gebunden an ΔHVR1 eE2 (grün) ist nicht dargestellt. Benachbarte Rückgratreste sind grau. Die Position der Y529- und W531-Seitenketten ist als Heteroatomstäbchen dargestellt und die Abstände sind angegeben.

Da die CD81-Bindungsschleife in jedem der vier zur Strukturbestimmung verwendeten Konstrukte vorhanden war, aber gleichzeitig mit Änderungen an der AS412/Frontschicht und der Stammregion unterschiedliche Konformationen annimmt, stellten wir die Hypothese auf, dass diese Unterschiede die CD81-Bindung regulieren. E2core allein kann menschliches CD81-LEL (hCD81-LEL) nicht binden, während eE2 im Vergleich zu tCD81-LEL15 mit geringerer Affinität an hCD81-LEL bindet. Wir haben daher untersucht, ob die E2-Stammregion die hCD81-LEL-Bindung beeinflussen könnte. Der E2core+-Stamm wurde mit humanem hCD81-LEL bei niedrigem pH-Wert inkubiert und anschließend mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) analysiert. Es wurde ein Puffer mit niedrigem pH-Wert verwendet, da die E2-Affinität für hCD81-LEL in Gegenwart eines niedrigen pH-Werts16 erhöht ist. Das Hinzufügen des Stamms zum E2core konnte hCD81-LEL in Gegenwart oder Abwesenheit von 2A12 Fab nicht binden (ergänzende Abbildung 1). Diese Ergebnisse identifizieren die vordere Schicht als entscheidende Determinante für CD81-LEL-Wechselwirkungen, im Einklang mit der aktuellen eE2/tCD81-LEL-Struktur16.

HCV eE2 weist eine grundlegende Membranbindung auf, die sowohl durch Ansäuerung als auch durch CD81-Wechselwirkung erhöht und durch Mutation von Ile422, Tyr529 oder Trp53113,16 eliminiert wird. Jedes der beiden Modelle könnte das Zusammenspiel zwischen der N-terminalen Region von E2 und der CD81-Bindungsschleife für die Membraninsertion erklären (Abb. 5). Wenn die Erweiterung der CD81-Bindungsschleife für die Membranbindung notwendig und ausreichend ist, wird durch die Löschung der regulatorischen N-terminalen Region die CD81-Bindungsschleife freigegeben, was zu einem E2-Protein führt, das in Abwesenheit von CD81 effizient Membranen bindet. Alternativ dazu, wenn die N-terminale Region dabei hilft, die CD81-Bindungsschleife auf eine Art und Weise zu präsentieren, die die Membraninsertion begünstigt, führt die Löschung der N-terminalen Region zu einem E2-Protein, das nicht in der Lage ist, Membranen zu binden. Ein Liposomen-Flotationstest wurde verwendet, um die Wirkung der Vorderschicht und des E2-Stamms auf die Membranbindung zu bewerten. Kurz gesagt, eE2, eE2+Stamm (Abb. 1a) oder E2core+Stamm wurden mit Liposomen in Gegenwart oder Abwesenheit von tCD81-LEL bei pH 5,0 inkubiert, in einem Saccharosegradienten aufgetrennt und durch Western Blot mit einem E2core-spezifischen Nachweis nachgewiesen Antikörper (Abb. 6, ergänzende Abb. 3). tCD81-LEL wurde im Flotationstest verwendet, da Tamarin CD81 die HCV-Infektion unterstützt und E2 mit höherer Affinität bindet16,22,23. Freie Proteine bleiben am unteren Ende des Saccharosegradienten, wohingegen an Liposomen gebundene Proteine zum oberen Ende des Gradienten wandern. eE2 zeigt eine dramatische Liposomenassoziation bei niedrigem pH-Wert in Gegenwart von tCD81-LEL, während die Hinzufügung der Stammregion (eE2+Stamm) bei Zugabe von tCD81-LEL zu einem moderateren Signalanstieg führt. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Stammregion (60 Reste) in Abwesenheit von E1 ungeordnet ist, was die Membranassoziation hemmt. Im Gegensatz dazu zeigte der E2core+-Stamm keine Membranassoziation und Flotation bei niedrigem pH-Wert, unabhängig von der Anwesenheit von tCD81-LEL. Eine an eE2 mit oder ohne HVR1 durchgeführte Liposomenflotation zeigte bei niedrigem pH-Wert in Abwesenheit und Gegenwart von tCD81-LEL eine äquivalente Bindung an Liposomen. Somit hat HVR1 einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Fähigkeit von E2, mit der Membran zu interagieren (ergänzende Abbildung 4). Die Ergebnisse der Liposomen-Flotationstests (Abb. 6 und ergänzende Abb. 4) unterstreichen die wichtige Rolle der Vorderschicht bei der Organisation der CD81-Bindungsschleife für die Membranassoziation. Die Flotation von eE2 steht im Einklang mit früheren Erkenntnissen, dass die Alaninsubstitution von Ile422 der Vorderschicht (die in der zurückgezogenen Form der CD81-Bindungsschleife an Tyr529 angrenzt) bei der Membranassoziation fehlschlägt16. In der E2core+Stamm-Struktur ist die CD81-Bindungsschleife in die entgegengesetzte Richtung gebogen, wobei Tyr529 und Trp531 innerhalb der Schleife gebunden sind (ergänzende Abbildung 2). Zusammenfassend sind die vordere Schicht von E2, der CD81-Rezeptor und ein niedriger pH-Wert allesamt wesentliche Voraussetzungen für die ordnungsgemäße Darstellung der CD81-Bindungsschleife für die Membranbindung.

a Die vollständige menschliche CD81-Struktur (Banddiagramm mit gelb gefärbten Transmembranhelices) und das koordinierte Cholesterinmolekül (hellgrüne Heteroatomstäbchen) (PDB-ID: 5TCX) wurden an eine idealisierte Palmitoyloleoylphosphatidylcholin (POPC)-Membrandoppelschicht angedockt44. Parallele Ebenen grauer Kugeln stellen die Carbonyleinheiten dar, die den hydrophoben Kern der Membrandoppelschicht definieren, und repräsentative Phospholipide sind an die Doppelschicht angedockt und als blaugrüne Heteroatomstäbchen dargestellt. Banddiagramme von CD81-LEL (himmelblau) und CD81-Bindungsschleife von verlängerten (ΔHVR1 eE2) und gebogenen (E2core+Stamm) Strukturen sind in Grün bzw. Rot dargestellt. b Die Tafel ist eine Vergrößerung der CD81-Bindungsschleife und eines Teils der Membran und zeigt die relativen Abstände (gestrichelte Linien) von Tyr529 und Trp531 vom hydrophoben Membrankern.

a Western Blots der oberen, mittleren und unteren Fraktionen aus dem Liposomen-Flotationsassay. Der Proteinmolekulargewichtsmarker und der eE2-Beladungskontrollmarker sind mit L bzw. M gekennzeichnet. Der Flotationstest wurde in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt und ein Test wird vorgestellt. Jedes Experiment zeigte den gleichen Trend; das heißt, keine Flotation von E2core+Stamm mit und ohne tCD81-LEL bei niedrigem pH-Wert, während in Gegenwart von tCD81-LEL für eE2 ein deutlicher Signalanstieg und eine geringere Verstärkung mit eE2+Stamm zu verzeichnen ist. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 3. b Quantifizierung des Western-Blots der obersten Fraktion mit willkürlichen Einheiten.

Hier beschreiben wir die Regionen von HCV E2, die für die CD81-Bindung und die Regulierung der CD81-Bindungsschleife für die Membranassoziation erforderlich sind, und liefern einzigartige, mechanistische Einblicke in den HCV-Eintritt. Obwohl die CD81-Bindungsschleife von E2 an der Membranbindung beteiligt ist, ist die Schleife für die Membranbindung notwendig, aber nicht ausreichend. Die N-terminale Region, die in ungebundener Form an die CD81-Bindungsschleife angrenzt, ist auch für die Membranbindung notwendig. Diese N-terminale Region, einschließlich AS412 und der Vorderschicht, bildet die CD81-Bindungsstelle, die die primäre Stelle der Antikörper-vermittelten Neutralisierung ist, die die Membranbindung durch Ile422 beeinflusst. Wir schließen daraus, dass dieser Mechanismus fein abgestimmt ist und nicht nur die Summe seiner Teile.

Hier zeigen wir die Struktur des E2core+Stammfragments, das an das nicht neutralisierende Fab 2A12 gebunden ist, bestimmt mit einer Auflösung von 2,5 Å. Die Strukturen des E2core+Stamm-, E2core-, eE2- und ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL-Komplexes bieten einzigartige mechanistische Einblicke in den frühen Stadien der Infektion und liefern ein Modell für Veränderungen, die während der Rezeptorbindung und der endosomalen Ansäuerung auftreten (Abb. 6). Die E2core-Region enthält die gefaltete, kugelförmige Domäne. Der AS412 und die Frontschicht sind die entscheidenden Faktoren für die richtige Positionierung der CD81-Bindungsschleife und der CD81-Interaktion. In Abwesenheit von CD81 hält Ile422 der vorderen Schicht die CD81-Bindungsschleife in der zurückgezogenen Position. Sowohl der E2core- als auch der E2core+-Stamm konnten hCD81 in vitro nicht binden, was die Bedeutung der N-terminalen Region (384-459) bei der Rezeptorbindung zeigt. HCV verwendet wie das Vogelsarkom-Leukose-Virus (ASLV) eine Hybridmethode der Membrananheftung, die einen zellulären Rezeptor und einen niedrigen pH-Wert erfordert24. Unter diesen Bedingungen erfährt E2 zwei Konformationsänderungen: Die vordere Schicht interagiert mit CD81, faltet die AS412-Region um CD81 und eine interne Schleife (CD81-Bindungsschleife) erstreckt sich dann vom Kern weg (Abb. 7a). Zwei invariante hydrophobe Reste (Tyr529 und Trp531) an der Spitze der CD81-Bindungsschleife erstrecken sich in Richtung Wirt und werden in die Membran eingefügt. Durch das Löschen der E2-Frontschicht wird die CD81-Interaktion aufgehoben und die CD81-Bindungsschleife freigegeben (Abb. 7b). Allerdings war der E2core+-Stamm nicht zur Membranbindung fähig, was darauf hindeutet, dass die CD81-Bindungsschleife allein für die Membranbindung nicht ausreicht und für die richtige Ausrichtung die vordere Schicht benötigt (Abb. 6). Insgesamt liefern diese vier Strukturen ein mechanistisches Bild der Flexibilität der CD81-Bindungsschleife, der regulatorischen Funktion der N-terminalen Region und ein detailliertes Verständnis des viralen Eintrittsprozesses.

a In Gegenwart von CD81 und niedrigem pH-Wert wickelt sich die vordere Schicht um CD81 und dann erstreckt sich die CD81-Bindungsschleife in Richtung der Wirtsmembran. b Die Deletion der vorderen Schicht von E2 führt zur Freisetzung der CD81-Bindungsschleife, die selbst bei niedrigem pH-Wert nicht an CD81 bindet und die Fähigkeit zur Interaktion mit Membranen verliert.

Alle Hüllviren interagieren und verschmelzen mit Zellmembranen, um das virale Genom in die Zelle zu transportieren. Modellierung des E2/tCD81-LEL-Komplexes auf der Volllängenstruktur von CD81 (PDB-ID: 5TCX25). Tyr529 und Trp531 befinden sich an der Spitze der CD81-Bindungsschleife, die sich in Richtung der Doppelschicht erstreckt (Abb. 5). Diese Reste sind bei allen wichtigen Genotypen invariant und werden für die CD81-Bindung und den Viruseintritt benötigt26,27. Durch die Überlagerung der E2core+Stamm-Struktur auf den eE2/Volllängen-CD81-Komplex werden Tyr529 und Trp531 in Abständen von mehr als 35 Å bzw. 31 Å von einer idealisierten Phosphatidylcarbonylschicht vom äußeren Blättchen der Membran entfernt platziert (Abb. 5). ). Die N-terminale Region von E2 kann dabei helfen, die CD81-Bindungsschleife zur Membran hin auszurichten. Das Modell in Abb. 5 verwendet eine idealisierte Doppelschicht. Die Flexibilität der CD81-Bindungsschleife kann jedoch während einer HCV-Infektion von Vorteil sein, wenn die Krümmung der Wirtsmembran im Endosom und das Vorhandensein anderer Faktoren (z. B. E1, OCLN und/oder CLDN) eine Schleifenflexibilität für die Membraninsertion erforderlich machen können .

Virale Membranfusionsproteine werden auf der Grundlage struktureller Kriterien in drei Klassen (I, II und III) mit vier Mechanismen zur Auslösung der Fusion eingeteilt24. Derzeit ist das HCV-Fusionsprotein nicht endgültig identifiziert, geschweige denn klassifiziert. Es wird angenommen, dass das HCV-E1-Glykoprotein die fusogene Untereinheit des E1E2-Heterodimers ist, da es ein mutmaßliches Fusionspeptid enthält28,29. Die CD81-Bindungsschleife von E2 hat jedoch Membranbindungseigenschaften und E2 enthält eine IgG-ähnliche Beta-Sandwich-Faltung, ähnlich den Typ-II-Fusionsproteinen24,30. Erschwerend kommt hinzu, dass E1 und E2 für eine effiziente Virus-/Wirtsfusion erforderlich sind, eine Eigenschaft, die keiner Klasse zugeschrieben wird. Höchstwahrscheinlich ist die CD81-Bindungsschleife in die Zielmembran eingebettet und unterstützt den Fusionsprozess. Alle fusogenen, viralen Proteine sind trimer, es wurden jedoch keine Hinweise auf ein E2-Trimer gefunden, obwohl die TM-Helix oder E1 die Oligomerisierung beeinflussen können. Kürzlich wurde die CryoEM-Struktur des E1E2-Glykoproteins im Komplex mit drei neutralisierenden Fabs veröffentlicht21, die eine einzelne Kopie des E1E2-Heterodimers enthält. In ähnlicher Weise führte der Einschluss des Stamms nicht zu Trimeren in der eE2+Stammstruktur, obwohl dies möglicherweise auf den 2A12-Fab zurückzuführen ist, der am Carboxylterminus des E2-Proteins interagiert. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um Einblicke in den HCV-Fusionsprozess zu gewinnen.

Es wurde gezeigt, dass SR-BI und CD81 nach der anfänglichen Bindung an die anfällige Zelle direkt mit E2 interagieren. SR-BI bindet über das N-terminale HVR1, wohingegen CD81 über eine diskontinuierliche Region, die AS412, AS432, die CD81-Bindungsschleife und die Rückschicht umfasst, an das E2-Protein bindet6,16. Der molekulare Mechanismus der SR-BI-Wechselwirkung mit E2 bleibt jedoch unklar. CD81 mit einem niedrigen pH-Auslöser kann ausreichen, um Konformationsänderungen auszulösen. Es besteht die Möglichkeit, dass SR-BI Konformationsänderungen auf HCV-Isolat-abhängige Weise wirksam induzieren könnte31,32.

Die Verwendung des sekundären Rezeptors CD81 zur Fusion ist für das Virus von Vorteil und steht im Einklang mit früheren Beobachtungen13. Während E2 und CD81-LEL bei neutralem pH-Wert einen Komplex bildeten und dies möglicherweise auch an der Zelloberfläche tun, nehmen die Stabilität und Homogenität des Komplexes bei niedrigem pH-Wert zu, was mit einer endosomalen Ansäuerung vereinbar ist. tCD81-LEL nimmt eine offene Konformation an, in der die D-Helix abgewickelt ist, während menschliches CD81 am häufigsten in der geschlossenen Konformation beobachtet wurde; es wurden auch Zwischen- und offene Konformationen beschrieben33. Die E2/tCD81-LEL-Struktur ist nur eine Momentaufnahme des Komplexes nach der Ansäuerung und vor jeglicher fusionsinduzierten Konformationsänderung. Wie bei der Beschreibung anderer viraler Fusionsproteine sind zusätzliche strukturelle und mechanistische Studien erforderlich, um den Fusionsmechanismus von HCV angemessen zu beschreiben.

Die HVRs von E2 umfassen einen erheblichen Anteil an HCV-Sequenzvarianten. Diese Regionen sind eine Möglichkeit, die Antikörperumgehung zu neutralisieren. Bei Patienten verändert sich HVR1 aufgrund der antikörpergesteuerten Antigendrift schnell. Breit neutralisierende Antikörper richten sich gegen die konservierten Konformationsepitope von HCV E2, die mit der CD81-Bindungsstelle konkurrieren. Die CD81-Bindungsschleife liegt an der Oberfläche frei und ist durch Konformationsverschleierung vor einer Antikörper-vermittelten Neutralisierung geschützt. Die Identifizierung der CD81-Bindungsschleife in der Membraninsertion bietet ein Ziel für die Entwicklung eines HCV-Impfstoffs. Die relativ hohe Konservierung der CD81-Bindungsschleifensequenz bei verschiedenen HCV-Genotypen und die Beobachtung, dass Membranbindungsschleifen anderer Viren, einschließlich HIV34, Ebola35,36,37, Inluenza38 und Denguefieber39, Hauptziele für Impfstoffe und neutralisierende Antikörper sind, legen nahe, dass die CD81 -Bindungsschleife von HCV könnte ein potenzielles therapeutisches Ziel sein. Die aus diesen atomaren Kristallstrukturen gewonnenen Informationen könnten bei der Entwicklung prophylaktischer HCV-Impfstoffdesigns nützlich sein.

Die E2-Fragmente des HCV-Isolats J6 (E2core+Stammreste 456–713, eE2+Stammreste 384–713 und eE2-Rest 384–656) und CD81-LEL (Reste 112–202 von Mensch und Tamarin) wurden in HEK293T GnTI( –) Zellen (ATCC, CRL-3022) und gereinigt wie zuvor beschrieben40. Kurz gesagt enthält ein lentiviraler Vektor einen CMV-Promotor, eine Prolaktin-Signalsequenz, ein J6-E2-Fragment wie oben angegeben und eine HRV3C-Spaltungsstelle, gefolgt von C-terminalen Protein-A- und Flag-Tags. Die stabil exprimierenden HEK293T GnTI(–)-Zellen wurden durch lentivirale Transduktion hergestellt. Anschließend wurden die Zellen in einem adhärenten Zellbioreaktor (Cesco Bioengineering) für langfristiges Wachstum und Proteinproduktion gezüchtet. Überstehende Medien wurden alle 2 Tage gesammelt und mittels IgG-Affinitätschromatographie und anschließendem HRV3C-Protease-In-Säulen-Verdau gereinigt. Das Protein wurde durch subtraktive Chromatographie über GST- und Q-Säulen und anschließende Größenausschlusschromatographie mit einer Superdex200-Säule (Cytiva Life Sciences) in hoher Qualität gereinigt. Die Endausbeute jedes Proteins betrug etwa 5–10 mg/l Überstand.

Das Protokoll wurde aus einer früheren Studie übernommen16. Kurz gesagt, die Maus-2A12-Hybridomzelllinie wurde im CELLine Classic-Bioreaktorkolben (Sigma-Aldrich) gezüchtet. 6 ml 6 × 106 Zellen in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) mit 15 % FBS mit niedrigem IgG-Gehalt und 10 mM HEPES pH 7,5 (Kulturmedium) wurden in die Innenschicht des Kolbens geimpft. Die obere Membran wurde mit 350 ml IMDM mit 1 % FBS mit niedrigem IgG-Gehalt und 10 mM HEPES pH 7,5 (Nährmedium) ergänzt. Sobald die Zellkonfluenz 6 × 108 erreichte, wurde das Kulturmedium gesammelt und 20 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Das überstehende 2A12-Medium wurde über die Protein-G-Säule weiter gereinigt. Vor der Papain-Verdauung zur Herstellung von 2A12-Fab wurde der gereinigte 2A12-Antikörper in 20 mM Natriumphosphat, pH 7,0, und 10 mM EDTA dialysiert, und Cystein-HCl wurde bis zu einer Endkonzentration von 20 mM zugegeben und der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt. Ungefähr 100 μl immobilisiertes Agarkügelchen Papain (Thermo Fisher Scientific) wurden für 20 mg 2A12-Antikörper verwendet und eine 100 %ige Verdauung wurde durch Inkubation bei 22 °C über Nacht durch sanftes Umdrehen erreicht. Die Verdauungsreaktion wurde gestoppt, indem das immobilisierte Papain durch 20-minütige Zentrifugation bei 4200 × g und 4 ° C entfernt wurde. Gereinigtes 2A12-Fab wurde durch eine zweistufige Reinigung über eine Protein-A-Säule und eine Protein-G-Säule erreicht. Zur Reinigung wurden 20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM NaCl und 5 % Glycerin verwendet, während für die Protein G-Säule gebundenes 2A12 Fab durch 0,05 % TFA eluiert wurde, das sofort durch 1 M Tris, pH 8,0, neutralisiert wurde. Das 2A12-Fab wurde zur weiteren Verwendung und Langzeitlagerung in 20 mM Tris, pH 8,0, entsalzt.

E2core+Stamm (Reste 456–713) wurde mit 2A12 Fab im Verhältnis 1:1,2 (Gew./Gew.) rekonstituiert und hCD81-LEL wurde im Molverhältnis 1:1,3 hinzugefügt. Der Komplex wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert. Der Komplex wurde in 20 mM Natriumcitrat, pH 4,5, 100 mM NaCl-Puffer durch Größenausschlusschromatographie mit einer Superdex200-Säule (Cytiva Life Sciences) gereinigt. Der Hauptpeak (ergänzende Abbildung 1) wurde gesammelt und durch eine Amicon Ultra Centrifugal Filtration Unit (Millipore) mit einem MW-Cut-off von 3 kDa auf eine Endkonzentration von 5 mg/ml konzentriert. Die Analyse der Peaks der Größenausschlusschromatographie zeigt, dass hCD81-LEL nicht an den Komplex bindet (ergänzende Abbildung 1B). Der E2core+Stamm/2A12-Fab-Komplex wurde im kleinen Maßstab, 400 nL, Tropfengröße unter Verwendung eines Mosquito-Liquid-Handling-Systems (SPT Labtech) mit verschiedenen Kristallisationssieben (Hampton Research) aufgebaut. Kristalle mit Beugungsqualität wurden in einem Hampton HR2-139-Sieb, Bedingung D10, gezüchtet; 0,2 M tribasisches Natriumcitrat-Dihydrat, 20 % w/v PEG 3350, pH 8,3. Die Kristalle wurden direkt aus 96-Well-Platten unter Verwendung von 30 % Ethylenglykol als Kryoschutzmittel eingefroren und in flüssigem Stickstoff blitzgekühlt. Die Daten wurden bei 0,979 Å an der SER-CAT 22-ID-Beamline am APS, Argonne National Laboratory, gesammelt.

E2core+Stamm (Reste 456–713)−2A12Fab-Kristalle gehören zur Raumgruppe P22121 mit Elementarzellenparametern a = 48,97 Å, b = 125,54 Å und c = 157,32 Å. Molekulare Phasen wurden von PHENIX_phaser41 unter Verwendung des PDB-Eintrags 7MWW als Ausgangsmodell bestimmt. Die eindeutige Platzierung der schweren und leichten Fab-Ketten lieferte die notwendigen Phasen, um die Karte mithilfe iterativer Modellbildungsrunden und Dichtemodifikationen durch Coot42 auf eE2-Koordinaten zu erweitern. Während jedes iterativen Verfeinerungszyklus wurde das Modell hinsichtlich verschiedener Qualitätsparameter bewertet. Das endgültige Modell wurde mit einer Auflösung von 2,45 Å erstellt. Das E2core+Stem-Modell enthält die Reste 491–571, 596–653 und 2 N-Acetylglucosamine, während die Reste 456–490, 572–595 und 653–713 aufgrund der Flexibilität fehlen. Das 2A12-Fab-Modell besteht aus den Resten 1–218 und 1–219 für die leichte bzw. schwere Kette. Das Modell wurde auf Rwork 0,203 und Rfree 0,231 verfeinert, wobei 96,12 % der Reste in den bevorzugten, 3,53 % erlaubten und 0,35 % Ausreißerregionen des Ramachandran-Diagramms mit der MolProbity-Software43 berechnet wurden. Der Gesamt-CC1/2 (Pearson-Korrelationskoeffizient) der verarbeiteten Daten beträgt 0,991 und der CC1/2 in der Außenhülle beträgt 0,571. Die Gesamtvollständigkeit der Daten beträgt 97,8 %, wobei 99,1 % in der äußeren Hülle mit Redundanz 4 bzw. 4,2 liegen. Die Datenverarbeitungs- und Verfeinerungsstatistiken sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Der Liposomen-Flotationstest wurde mit geringfügigen Änderungen angepasst16. 15 μg eines J6-E2-Fragments [eE2core+Stamm (Reste 456–713), eE2 (Reste 384–656), eE2+Stamm (Reste 384–713) oder ΔHVR1 eE2 (406–656)] wurden mit 18 gemischt μg CD81-LEL (ein sechsfacher molarer Überschuss von CD81-LEL) und Volumen mit 20 mM Natriumcitrat pH 5,0 und 100 mM NaCl auf 60 μl eingestellt. Die Proben wurden über Nacht bei 4 °C auf Eis inkubiert. 54 μl 200-nm-Soja-PC: Cholesterin-Liposomen (Molverhältnis 70:30) von Encapsula NanoSciences (Stammlösung 10 mM oder 8 μg/μL) (CPC-610) wurden zugegeben und 1 Stunde lang bei 37 °C unter leichtem Klopfen inkubiert in bestimmten Abständen. Nach der Inkubation wurden 67 μl 3 M KCl bis zu einer Endkonzentration von 1 M KCl zugegeben und 15 Minuten bei 37 °C inkubiert, um die unspezifische elektrostatische Assoziation zwischen Proteinen und Lipiden zu minimieren. Dann wurden 67 % (Gew./Vol.) Saccharose in 20 mM Natriumcitrat, pH 5,0, und 100 mM NaCl-Puffer bis zu einer Endkonzentration von 40 % in einem Endvolumen von 500 μl zugegeben. Die Probe wurde vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette gemischt und dann unter einem Stufengradienten von 0,1 ml 5 % und 11,4 ml 25 % (Gew./Vol.) Saccharose in ein oben offenes, dünnwandiges, ultraklares Zentrifugenröhrchen (Beckman Coulter, 344060) gegeben ). Die Gradienten wurden 150 Minuten lang bei 4 ° C und 281.000 × g in einem SW40 Ti-Ausschwingrotor (Beckman Coulter Optima XL-100K Ultracentrifuge) zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde jeder Gradient von oben nach unten in 20 Fraktionen zu je 600 μl fraktioniert. Die oberen oder mittleren Fraktionen wurden dann in Amicon Ultra-0,5-ml-Zentrifugalfiltereinheiten mit einem MW-Cut-off von 10 kDa (Millipore) bei einer Geschwindigkeit von 10.000 × g auf ein Endvolumen von 150 μl konzentriert. Zu jeder dieser Proben wurden 15 μl 10× SDS-PAGE-Reduktionsfarbstoff für die Western-Blot-Analyse hinzugefügt.

Alle Fraktionen wurden mit 10-fachem SDS-PAGE-Reduktionsprobenpuffer auf eine Endkonzentration von 1-fach verdünnt und 5 Minuten lang bei 95 °C denaturiert. 50 μl jeder Probe wurden zusammen mit dem eE2-Marker und einem Odyssey Protein Molecular Weight Marker (Li-Cor) (L) auf 4–20 % Bis-Tris-Fertiggelen (Bio-Rad) laufen gelassen. Anschließend wurden die Proteine mit einem Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad) auf PVDF-Membranen übertragen. Die Membran wurde mit Intercept (PBS) Blocking Buffer (Li-Cor) 1 Stunde lang bei 37 °C blockiert, gefolgt von einer Inkubation des Blots mit einer 1:500-Verdünnung einer gereinigten 8A6-Maus über Nacht bei 4 °C. Die primäre Antikörperverdünnung wurde in Odyssey Blocking Buffer in PBS mit 0,05 % Tween 20 (Sigma-Aldrich) hergestellt. Der sekundäre Antikörper, IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (Li-Cor, 926-32210), wurde in einer Verdünnung von 1:10.000 verwendet. Der Western Blot wurde mit der Li-Cor Odyssey-Software (v.3.0) gescannt.

Der monoklonale Antikörper 8A6 wurde im Labor von Dr. Arash Grakoui (IACUC-Protokollnummer YER-2002369-070816GN, Emory University School of Medicine, Atlanta, Georgia, USA) erzeugt. BALB/c-Mäuse wurden 8 Wochen lang alle zwei Wochen intraperitoneal mit 50 μg eE2 entweder in vollständigem Freund-Adjuvans (nur erste Immunisierung) oder in unvollständigem Freund-Adjuvans immunisiert. Eine letzte Immunisierung mit 50 μg eE2 wurde vier Tage vor der Splenozytensammlung intravenös verabreicht. Hybridome wurden unter Verwendung einer geklonten HAT-empfindlichen Maus-Myelomzelllinie als Fusionspartner erzeugt. Proliferierende Hybridome wurden mittels ELISA auf ihre Fähigkeit zur Bindung von eE2 untersucht, wobei 8A6 positiv identifiziert wurde.

Hybridomzellen wurden in IMDM (Hyclone) expandiert, das 10 % FCS mit niedrigem IgG-Gehalt (Hyclone) und Gentamicin (Gibco) enthielt. Der Überstand wurde gesammelt und durch 10-minütige Zentrifugation bei 4000 × g und 4 ° C geklärt. Monoklonale Antikörper wurden mittels Protein-G-Affinitätssäulenchromatographie gereinigt und unter Verwendung von Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltereinheiten (Millipore) konzentriert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Die in dieser Studie generierten Koordinaten und Strukturfaktoren wurden in der Proteindatenbank (PDB) unter dem Zugangscode 8DK6 (E2-Kern+Stamm/2A12-Fab) hinterlegt. Zuvor veröffentlichte Strukturen, die in dieser Studie verwendet wurden, sind unter den Zugangscodes 4WEB (E2-Kern), 7MWW (eE2-Struktur), 7MWX (ΔHVR1 eE2/tCD81-LEL) und 5TCX (CD81 in voller Länge) zu finden.

Axley, P., Ahmed, Z., Ravi, S. & Singal, AK Hepatitis-C-Virus und hepatozelluläres Karzinom: eine narrative Übersicht. J. Clin. Übers. Hepatol. 6, 79–84 (2018).

Artikel Google Scholar

Globaler Fortschrittsbericht zu HIV, Virushepatitis und sexuell übertragbaren Infektionen., (2021).

Viral Hepatitis Surveillance Report 2019, (2019).

Baumert, TF, Berg, T., Lim, JK & Nelson, DR Status der direkt wirkenden antiviralen Therapie bei Hepatitis-C-Virusinfektionen und verbleibende Herausforderungen. Gastroenterology 156, 431–445 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Pileri, P. et al. Bindung des Hepatitis-C-Virus an CD81. Wissenschaft 282, 938–941.

Artikel ADS CAS Google Scholar

Scarselli, E. et al. Der menschliche Scavenger-Rezeptor Klasse B Typ I ist ein neuer Rezeptorkandidat für das Hepatitis-C-Virus. EMBO J. 21, 5017–5025 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Evans, MJ et al. Claudin-1 ist ein Co-Rezeptor des Hepatitis-C-Virus, der für einen späten Eintrittsschritt erforderlich ist. Natur 446, 801–805 (2007).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Ploss, A. et al. Humanes Occludin ist ein Eintrittsfaktor für das Hepatitis-C-Virus, der für die Infektion von Mauszellen erforderlich ist. Natur 457, 882–6 (2009).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Tzarum, N., Wilson, IA & Law, M. Die neutralisierende Seite des E2-Hüllglykoproteins des Hepatitis-C-Virus. Vorderseite. Immunol. 9, 1315 (2018).

Artikel Google Scholar

Feneant, L., Levy, S. & Cocquerel, L. CD81- und Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektion. Viren 6, 535–572 (2014).

Artikel Google Scholar

Gerold, G., Moeller, R. & Pietschmann, T. Hepatitis-C-Viruseintritt: Proteininteraktionen und Fusionsdeterminanten, die die produktive Hepatozyteninvasion steuern. Kalter Frühling Harb. Perspektive. Med. 10, a036830 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Tscherne, DM et al. Zeit- und temperaturabhängige Aktivierung des Hepatitis-C-Virus für einen durch niedrigen pH-Wert ausgelösten Eintritt. J. Virol. 80, 1734–1741 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Sharma, NR et al. Das Hepatitis-C-Virus wird durch das CD81-Protein auf eine Fusion vorbereitet, die von einem niedrigen pH-Wert abhängt. J. Biol. Chem. 286, 30361–30376 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Drummer, HE & Poumbourios, P. Das Hepatitis-C-Virus-Glykoprotein E2 enthält eine membrannahe Heptad-Wiederholungssequenz, die für die Heterodimerisierung des E1E2-Glykoproteins und den Viruseintritt wesentlich ist. J. Biol. Chem. 279, 30066–30072 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Khan, AG et al. Struktur der Kernektodomäne des Hüllglycoproteins 2 des Hepatitis-C-Virus. Nature 509, 381–384 (2014).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Kumar, A. et al. Strukturelle Einblicke in die Bindung und den Eintritt des Hepatitis-C-Virus-Rezeptors. Natur 598, 521–525 (2021).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Flyak, AI et al. Breit neutralisierende HCV-Antikörper nutzen ein CDRH3-Disulfidmotiv, um eine E2-Glykoproteinstelle zu erkennen, die für die Impfstoffentwicklung anvisiert werden kann. Cell Host Microbe 24, 703–716 e703 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Kong, L. et al. Hepatitis-C-Virus-E2-Hüllen-Glykoprotein-Kernstruktur. Science 342, 1090–1094 (2013).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Flyak, AI et al. Ein ultralanger CDRH2-in-HCV-neutralisierender Antikörper zeigt die strukturelle Plastizität von Antikörpern gegen E2-Glykoprotein. Elife 9, e53169 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Tzarum, N. et al. Genetische und strukturelle Einblicke in die umfassende Neutralisierung des Hepatitis-C-Virus durch menschliche VH1-69-Antikörper. Wissenschaft. Adv. 5, eaav1882 (2019).

Artikel ADS Google Scholar

Torrents de la Pena, A. et al. Struktur des Hepatitis-C-Virus-E1E2-Glykoproteinkomplexes. Wissenschaft 378, 263–269 (2022).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Flint, M. et al. Diverse CD81-Proteine unterstützen die Infektion mit dem Hepatitis-C-Virus. J. Virol. 80, 11331–11342 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Allander, T., Forns, X., Emerson, SU, Purcell, RH & Bukh, J. Das Hüllprotein E2 des Hepatitis-C-Virus bindet an CD81 von Tamarinen. Virology 277, 358–367 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

White, JM & Whittaker, GR Fusion umhüllter Viren in Endosomen. Verkehr 17, 593–614 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Zimmerman, B. et al. Die Kristallstruktur eines menschlichen Tetraspanins voller Länge zeigt eine Cholesterin-bindende Tasche. Zelle 167, 1041–1051 e1011 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Rothwangl, KB, Manicassamy, B., Uprichard, SL & Rong, L. Untersuchung der Rolle der mutmaßlichen CD81-Bindungsregionen von E2 bei der Vermittlung des HCV-Eintritts: Die mutmaßliche CD81-Bindungsregion 1 ist nicht an der CD81-Bindung beteiligt. Virol. J. 5, 46 (2008).

Artikel Google Scholar

Owsianka, AM et al. Identifizierung konservierter Reste im E2-Hüllglykoprotein des Hepatitis-C-Virus, die für die CD81-Bindung entscheidend sind. J. Virol. 80, 8695–8704 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Drummer, HE, Boo, I. & Poumbourios, P. Mutagenese eines konservierten Fusionspeptid-ähnlichen Motivs und einer membranproximalen Heptad-Repeat-Region des Hepatitis-C-Virus-Glykoproteins E1. J. General Virol. 88, 1144–1148 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Li, HF, Huang, CH, Ai, LS, Chuang, CK & Chen, SS Mutagenese der Fusionspeptid-ähnlichen Domäne des Hepatitis-C-Virus-E1-Glykoproteins: Beteiligung an der Zellfusion und dem Viruseintritt. J. Biomed. Wissenschaft. 16, 89 (2009).

Artikel Google Scholar

Krey, T. et al. Die Disulfidbindungen im Glykoprotein E2 des Hepatitis-C-Virus offenbaren die tertiäre Organisation des Moleküls. PLoS Pathog. 6, e1000762 (2010).

Artikel Google Scholar

Augestad, EH, Bukh, J. & Prentoe, J. Hepatitis-C-Virus-Hüllproteindynamik und die Verbindung zur hypervariablen Region 1. Curr. Meinung. Virol. 50, 69–75 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Stejskal, L. et al. Ein entropischer Sicherheitsverschluss kontrolliert das Eindringen des Hepatitis-C-Virus und die Antikörperresistenz. Elife 11, e71854 (2022).

Artikel Google Scholar

Cunha, ES et al. Mechanismus der strukturellen Abstimmung der großen extrazellulären Schleife des menschlichen Zellrezeptors CD81 des Hepatitis-C-Virus. Struktur 25, 53–65 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Chuang, GY et al. Entwicklung eines 3Mut-Apex-stabilisierten Hülltrimers, das die Hiv-1-Neutralisierungsbreite erweitert, wenn es zur Verstärkung von Fusionspeptid-gesteuerten, durch Impfstoffe ausgelösten Reaktionen verwendet wird. J. Virol. 94, e00074–20 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Janus, BM et al. Strukturelle Grundlage für die breite Neutralisierung von Ebolaviren durch einen Antikörper, der auf die Glykoprotein-Fusionsschleife abzielt. Nat. Komm. 9, 3934 (2018).

Artikel ADS Google Scholar

Milligan, JC et al. Strukturelle Charakterisierung des Pan-Ebolavirus-Antikörpers 6d6, der auf das Fusionspeptid des Oberflächenglykoproteins abzielt. J. Infizieren. Dis. 219, 415–419 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Zhao, X. et al. Durch die Immunisierung ausgelöster, umfassend schützender Antikörper zeigt, dass die Ebolavirus-Fusionsschleife eine Schwachstelle darstellt. Zelle 169, 891–904.e815 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Kallewaard, NL et al. Struktur- und Funktionsanalyse eines Antikörpers, der alle Influenza-A-Subtypen erkennt. Zelle 166, 596–608 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Costin, JM et al. Mechanistische Untersuchung weitgehend neutralisierender humaner monoklonaler Antikörper gegen Dengue-Virus, die auf die Fusionsschleife abzielen. J. Virol. 87, 52–66 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Yost, SA, Whidby, J., Khan, AG, Wang, Y. & Marcotrigiano, J. Überwindung der Herausforderungen der Produktion von Hüll-Glykoproteinen des Hepatitis-C-Virus in Säugetierzellen. Methoden Mol. Biol. 1911, 305–316 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Adams, PD et al. PHENIX: ein umfassendes Python-basiertes System zur Lösung makromolekularer Strukturen. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 66, 213–221 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, WG & Cowtan, K. Merkmale und Entwicklung von Blässhuhn. Acta Crystallogr. D. Biol. Kristalllogr. 66, 486–501 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Williams, CJ et al. MolProbity: mehr und bessere Referenzdaten für eine verbesserte Validierung der Gesamtatomstruktur. Proteinwissenschaft. 27, 293–315 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Lomize, MA, Pogozheva, ID, Joo, H., Mosberg, HI & Lomize, AL OPM-Datenbank und PPM-Webserver: Ressourcen für die Positionierung von Proteinen in Membranen. Nukleinsäuren Res. 40, D370–376 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir möchten M. Paskel für die hervorragende technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde durch die intramuralen Forschungsprogramme des Nationalen Instituts für Allergie- und Infektionskrankheiten (JM) und NIH -Zuschüsse R01AI136533, R01AI124680, R01AI126890 und U19AI159819 bis AGRRRRRRAL und OD/OD011132 (NCR P51RRRRAL) und OD/OD011132 (NCR P5165165165) unterstützt. Zentrum (AG). Die Nutzung der Advanced Photon Source wurde vom US-Energieministerium, dem Office of Science und dem Office of Basic Energy Sciences unter der Vertragsnummer W-31-109-Eng-38 (SER-CAT) unterstützt.

Open-Access-Förderung durch die National Institutes of Health (NIH).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ashish Kumar, Tiana C. Rohe.

Abteilung für strukturelle Virologie, Labor für Infektionskrankheiten, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 20892, USA

Ashish Kumar, Tiana C. Rohe, Altaira D. Dearborn und Joseph Marcotrigiano

Emory National Primate Research Center, Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Emory Vaccine Center, Emory University School of Medicine, Atlanta, GA, 30329, USA

Elizabeth J. Elrod & Arash Grakoui

Zentrum für fortgeschrittene Biotechnologie und Medizin, Rutgers, The State University of New Jersey, Piscataway, NJ, 08854, USA

Abdul G. Khan

Abteilung für Forschungstechnologie, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Hamilton, MT, 59840, USA

Ryan Kissinger

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

AGK produzierte das E2+-Stammkonstrukt und die exprimierende Zelllinie. AK und TCR reinigten die Proteine und bestimmten die Kristallisationsbedingungen. AK und JM sammelten, verarbeiteten und analysierten die Ergebnisse der Röntgenkristallographiedaten. AK und ADD haben die Membranflotationsdaten entworfen, durchgeführt und analysiert. EJE und AG produzierten den 8A6-Antikörper. RK hat das Modell entworfen und produziert. Alle Autoren halfen beim Verfassen und Bearbeiten des Manuskripts.

Korrespondenz mit Joseph Marcotrigiano.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Kumar, A., Rohe, TC, Elrod, EJ et al. Regionen des Hepatitis-C-Virus E2, die für die Membranassoziation erforderlich sind. Nat Commun 14, 433 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36183-y

Zitat herunterladen

Eingegangen: 08. August 2022

Angenommen: 19. Januar 2023

Veröffentlicht: 26. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36183-y

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.