Gründung eines Salzes

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1352 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Einleitung von Industrieabwässern, die landwirtschaftliche Produktion, die Seeschifffahrt, die Ölförderung und andere Aktivitäten haben zu schwerwiegender Meeresverschmutzung geführt, darunter Mikroplastik, Erdöl und seine Produkte, Schwermetalle, Pestizide und andere organische Stoffe. Die Effizienz der biologischen Sanierung von Meeresverschmutzungen kann durch hohe Salzkonzentrationen (>1 %, w/v) eingeschränkt sein, was zu einem offensichtlichen Verlust mikrobieller Aktivitäten führen kann. In dieser Studie wurden die funktionellen Promotoren P1, P2-1 und P2-2, die Salzstress zensieren, aus einem Vibrio natriegens-Stamm Vmax isoliert und identifiziert. Drei salzinduzierte Abbaumodelle wurden konstruiert, um Polyethylenterephthalat (PET), Chlorpyrifos (CP) und Hexabromcyclododecane (HBCDs) unter Verwendung des Meeresstamms Vmax abzubauen. Die manipulierten Stämme sind für den Abbau der entsprechenden Substrate effizient, wobei die Abbauraten bei 15 mg/L PET in 8 Tagen, 50 mg/L CP in 24 Stunden bzw. 1 mg/L HBCDs in 4 Stunden liegen. Darüber hinaus wurde eine Immobilisierungsstrategie für das Recycling und die Wiederverwendung gentechnisch veränderter Stämme durch die Expression des Chitin-bindenden Proteins GbpA realisiert. Diese Studie könnte dazu beitragen, Antworten auf die Frage zu finden, wie sich schnell wachsende Meeresbakterien wie V. natriegens Vmax für den effizienten Abbau der Meeresverschmutzung einsetzen lassen.

Mit den rasanten Fortschritten in Industrie und Landwirtschaft ist die schwere Meeresumweltverschmutzung zu einem herausragenden Problem für die wirtschaftliche und soziale Entwicklung geworden, insbesondere in Entwicklungsländern1. Meeresverschmutzung, einschließlich Schwermetalle, Erdöl, persistente organische Schadstoffe (POPs), Müll und Radionuklide, kann direkt oder indirekt schädlich für lebende Organismen und Ressourcen sein2. Die Plastikverschmutzung hat in den letzten 50 Jahren zugenommen, und der geschätzte Plastikgehalt im Meer beträgt mehr als 250.000 Tonnen3. Die Entfernung von Mikroplastik mittels Sorption und Filtration wurde entwickelt, beispielsweise durch die Absorption der Mikroplastikpartikel auf der Oberfläche von Meeresgrünalgen, die Filtration von Mikroplastik durch Membrantechnologie und sogar in Kombination mit Membranbioreaktoren, wobei die Entfernungseffizienz 97,2 %4 erreicht. Es wurde festgestellt, dass zwei Arten von Bacillus-Stämmen, die aus den Mangrovensedimenten isoliert wurden, unterschiedliche Mikroplastiken abbauen, wobei die Reduzierung lediglich 0,0019 mg/Tag betrug5.

Der Abbau von Mikroplastik im Meerwasser wurde jedoch nur wenig untersucht, und nur eine begrenzte Anzahl von Bakterien ist in der Lage, die Schadstoffe unter Meeresbedingungen mit einem Salzgehalt zwischen 3,3 und 3,7 % abzubauen.

Halotolerante Bakterien sind in der Lage, hohe Konzentrationen verschiedener organischer osmotischer gelöster Stoffe (OOS) anzusammeln, wie etwa kompatible gelöste Stoffe (wasserlösliche Zucker oder Zuckeralkohole, andere Alkohole, Aminosäuren oder deren Derivate), Ectoin, Trehalose und Glycinbetain usw.6 ,7,8,9,10. Diese OOS könnten dazu beitragen, ein osmotisches Gleichgewicht des Zytoplasmas mit der äußeren Umgebung aufrechtzuerhalten und so die normalen biologischen Aktivitäten der Zellen aufrechtzuerhalten. Viele Meeresorganismen sind leicht halophil (mit 3 % w/v NaCl im Meerwasser).

Der aus der Meeresumwelt isolierte V. natriegens-Stamm Vmax hat eine Generationszeit von weniger als 10 Minuten und kann ohne NaCl mit einer optimalen Konzentration von 2–3 % (Gew./Vol.) nicht wachsen11. Kassetten, die das T7-RNA-Polymerase-Gen unter der Kontrolle eines IPTG- oder Arabinose-induzierbaren Promotors (lacUV5 bzw. araBAD) enthielten, wurden in das große Chromosom von V. natriegens (ATCC 14048, der ursprüngliche Stamm von V. natriegens Vmax) eingefügt. Bei der Einführung von Expressionsplasmiden, die das GFP-Gen unter der Kontrolle des T7-Promotors enthielten, wurde eine robuste GFP-Expression nachgewiesen12. Allerdings gibt es nur wenige Berichte über die Verwendung von V. natriegens als Wirt für den Abbau von Umweltschadstoffen, insbesondere in der Meeresumwelt.

In dieser Studie wurde der Stamm Vmax zum Abbau von Umweltschadstoffen unter Salzstress eingesetzt. Zunächst wurden die Salztoleranzmechanismen des Stammes Vmax durch transkriptomische Analyse vorgeschlagen und die zugehörigen salzinduzierten Promotoren identifiziert und charakterisiert. Anschließend wurden drei Modelle zum Abbau von Chlorpyrifos (CP), Hexabromcyclododecanen (HBCDs) und Polyethylenterephthalat (PET) basierend auf den identifizierten Promotoren konstruiert. Der Recyclingeinsatz der manipulierten Stämme wurde durch die Bindung an Chitinmaterialien kontrolliert, die spezifisch für Vibrio-Arten sind und in der Meeresumwelt häufig vorkommen.

Um konstitutiv exprimierte Elemente zu finden, die durch Salz (NaCl oder Na+) induziert werden, wurde eine transkriptomische Analyse durchgeführt, in der die Behandlungsgruppe (Stamm Vmax, kultiviert mit 5 % (w/v) NaCl) mit der Kontrollgruppe (Stamm Vmax, kultiviert mit 1 % NaCl) verglichen wurde durchgeführt. Proben für die Transkriptomanalyse wurden in der Exponentialphase entnommen und die Gentranskriptionsniveaus mit Faltungsänderungen in Log2 wurden in einer Wärmekarte zusammengefasst (Abb. 1a). Insgesamt wurden 1596 Gene identifiziert, von denen 728 Gene hochreguliert und 868 Gene herunterreguliert waren. Die hochregulierten Gene konnten durch GO-Analyse in 25 Kategorien eingeteilt werden (Abb. 1b), wobei die katalytische Aktivität am stärksten reguliert wurde. Die am KEGG-Stoffwechselweg beteiligten hochregulierten Gene wurden dann in sechs Zweige unterteilt, von denen die Gene für ABC-Transporter (ko02010) und Zweikomponentensysteme (ko02020) die ersten häufig vorkommenden Gene waren (Abb. 1c).

a Die Heatmap, basierend auf einer hierarchischen Analyse unter Verwendung des log2 (5 %/1 %) für jedes Gen in zwei Gruppen (5 und 1 %), zeigte, dass 1.596 Gene erkannt wurden. Die Farben reichten von Blau bis Rot und repräsentierten die Werte von log2 (5 %/1 %). b Deutlich angereicherte GO-Kategorien für die Gene mit Faltungsänderungen in Log2 ≥ 4. c Differenzielle Gen-KEGG-Signalwegklassifizierung für die Gene mit Faltungsänderungen in Log2 ≥ 4. d Vorgeschlagener halophiler Mechanismus des Stamms Vmax basierend auf der Transkriptomanalyse.

Um mögliche mit Salzstress verbundene Elemente zu identifizieren, wurden Gene ausgewählt, die um mehr als das Vierfache hochreguliert waren (Ergänzungstabelle 3). Drei Gencluster im Zusammenhang mit Salzstress, darunter der Ectoin-Biosynthese-Gencluster ectBACD (hochreguliert um das 8,96-, 9,47- und 8,52-fache), Prolin/Glycin-Betain-ABC-Transporter proWXV (hochreguliert um das 9,02-, 8,86- und 8,79-fache). ) und Betain-Biosynthese-Gene BCCT (hochreguliert um das 6,20-, 6,09-fache) sowie ein Cluster bezüglich der Flagellin-Assemblierung (hochreguliert um das 7,16-, 5,59-, 5,43-, 4,38-, 4,24- und 4,07-fache). 52 hochregulierte Gene13. Der Na+/H+-Antiporter funktioniert typischerweise durch den Transport von Natriumionen, um den intrazellulären osmotischen Druck aufrechtzuerhalten, und sein Editiergen NhaC wurde um das 4,49-fache hochreguliert. Basierend auf den Ergebnissen der transkriptomischen Analyse schlagen wir vor, dass der Salztoleranzmechanismus des Stammes Vmax die Sekretion kompatibler gelöster Stoffe wie Ectoin oder Prolin/Glycin-Betain und die Verbesserung des Transports von Na+ über hochregulierte Transkriptionsniveaus von Genen beinhaltet, die der Synthese oder den Kanälen entsprechen (Abb. 1d).

Promotoren, die durch Salzstress induziert werden können, sind wichtige Elemente für das Überleben von Mikroorganismen in bestimmten Umgebungen. Um mögliche durch Salz induzierte Promotorelemente zu identifizieren, wurden die vorderen 400-bp-Sequenz der am stärksten hochregulierten Gene/Gencluster als Kandidaten ausgewählt. Die meisten der hochregulierten Gene waren zufällig im Genom verteilt, wobei die beiden hochregulierten Gencluster ectBACD und proWXV in entgegengesetzte Richtungen wiesen. Interessanterweise wurde ein Intervallbereich von 717 Basenpaaren zwischen den beiden Clustern identifiziert und es wurde vorhergesagt, dass er drei Promotoren mit zwei Richtungen enthält (Abb. 2a). Die Transkriptionsrichtung des Promotors P1 (AAACACTTTATAAAGTCCCTTAACTTCCAGTATGGGGTCCATGTAATCGT) stimmte mit dem Gencluster proWXV überein, und die Transkriptionsrichtung des Promotors P2 (P2-1: TTCAGAAGCTGTTAATAGCGCGGGGGATCGTAAATTAGAAAATA ATATAT; P2-2: TAAGGGACTTTATAAAGTGTTTGGTGAGAACCCAGAGCGT GCTTTCTCAC) war die gleiche wie für Cluster ectBACD.

ein Schema von zwei hochregulierten Genclustern mit drei vorgeschlagenen Promotoren. (Die Farbe stellt die Hochregulierung der Antwortgene dar; die Sequenzen bezeichnen den vorgeschlagenen Bereich für Promotoren und die vergrößerten Buchstaben stellen die Startstelle für die Transkription dar). b Flussdiagramm der Identifizierung und Charakterisierung der vorgeschlagenen Promotoren. c Nachweis der Fluoreszenzintensität für mRFP/eGFP in der Elementarzelle. P1 (400-bp-Gensequenz-Front-Cluster proWXV), P2-1 (reverse 400-bp-Sequenz-Front-Gencluster ectBACD) oder P2-2 (reverse 400-bp-Sequenz-Front-Cluster proWXV) und der Intervallbereich voller Länge (P12 und seine umgekehrte Reihenfolge war P21). Fehlerbalken sind der Standardfehler des Mittelwerts.

Die Region, die die Promotoren P1, P2-1 und P2-2 enthielt, wurde durch Ligation an pS8K-mRFP weiter charakterisiert. Es wurde eine gut sichtbare Expression des rot fluoreszierenden Proteins (mRFP) nachgewiesen und die gleichzeitige bidirektionale Aktivierung mit einem verstärkten grün fluoreszierenden Protein (eGFP)-Gen gemessen (Abb. 2b). Unter 3 % Na+-Stress entstehen die verkürzten Regionen, die nur die Promotoren P1 (400 bp Gensequenz-Frontcluster proWXV), P2-1 (reverse 400 bp Sequenz-Frontgencluster ectBACD), P2-2 (reverse 400 bp Sequenz-Frontcluster) enthalten proWXV) oder der Intervallbereich voller Länge (P12 und seine umgekehrte Sequenz war P21) weisen Transkriptionsaktivität auf (Abb. 2c). Wenn die Transkription des mRFP-Gens mit dem Promotor P2-2 initiiert wurde, wurde die stärkste Fluoreszenz festgestellt.

Um die Abbaufähigkeit der identifizierten Promotoren zu testen und zu verifizieren, wurden drei Abbaumodelle konstruiert und charakterisiert. Die wichtigsten funktionellen Gene im Zusammenhang mit dem CP-Abbau wurden unter der Kontrolle der Promotoren P1 und P2-1 konstruiert (Abb. 3a, b), was zu Vmax-mpdp12tcpXA führte. Hier konnten etwa 50 % des CP bei einer Anfangskonzentration von 100 mg/L in 8 Stunden abgebaut werden. Darüber hinaus wurde das Katalyseenzymsystem konstruiert, das eine Cytochrom-Monooxygenase (CYP168A1), ein 4Fe-4S-Ferredoxin (Fd) und eine NAD(P)H-abhängige Ferredoxin-Reduktase (FNR) aus P. aeruginosa HS9 enthält (Abb. 3c). , was zum Stamm Vmax-cyp168A1p12FdFNR führte. HBCDs (1 mg/l) konnten innerhalb von 8 Stunden vollständig in debromierte Produkte umgewandelt werden, einschließlich Pentabromcyclododecanole (PBCDOHs) und Tetrabromcyclododecadiole (TBCDDOHs) (Abb. 3d).

a Forschungsgrundlage zum Chlorpyrifos (CP)-Abbau und das Plasmiddiagramm für den salzinduzierten CP-Abbau. b Überprüfung der Stoffwechseleffizienz des Pestizids CP. c Forschungsgrundlage zum Hexabromcyclododecan (HBCD)-Abbau und das Plasmiddiagramm für den salzinduzierten HBCD-Abbau. d Überprüfung der Stoffwechseleffizienz der HBCDs.

Um die Effizienz der Transkription zu steigern, wurde ein drittes Modell konstruiert, bei dem der Promotorbereich von P1 auf P2-2 verkürzt wurde. Da PETase oder LCC PET zu Mono-(2-hydroxyethyl)terephthalsäure (MHET) und Bis-(2-hydroxyethyl)terephthalsäure (BHET) als Hauptprodukte katalysieren könnten, können MHETase oder Tfca BHET und MHET weiter zu Ethylen katalysieren Glykol (EG), Terephthalsäure (TPA) und andere Komponenten unter milden Bedingungen (Abb. 4a). Hier wurden vier manipulierte PET-Hydrolasen mit der höchsten katalytischen Aktivität ausgewählt, um salzinduzierte PET-abbauende Stämme zu konstruieren. Der Abbau von PET wurde durch die Bildung der Hydroxylierungsprodukte BHET und MHET bestätigt. Sowohl ganze Zellen als auch Rohzellen konnten PET abbauen, und die Abbaueffizienzen waren unterschiedlich (Abb. 4b, c). Für ganze Zellen wurden die Abbauraten der vier konstruierten Konstrukte wie folgt eingestuft: Vmax-MHETaseP122PETase (MPP) > Vmax-PETaseP122MHETase (PPM) > Vmax-TfcaP122LCC (TPL) > Vmax-LCCP122Tfca (LPT). Die Produkte BHET und MHET wurden mit einer maximalen Akkumulation bei 10 mg/L und 11 mg/L nach 8 Tagen in den MPP-Konstrukten nachgewiesen (Abb. 4b). Für die Rohenzyme der PPM-Konstrukte akkumulierten BHET und MHET in den ersten 24 Stunden auf 5,0 bzw. 40 mg/L und sanken nach 48 Stunden auf 0 (Abb. 4c). Für die Rohenzyme der MPP-Konstrukte akkumulierten BHET und MHET in den ersten 24 Stunden bzw. 60 Stunden auf 127 bzw. 14 mg/L. Für die Rohenzyme der LPT-Konstrukte akkumulierten BHET und MHET in den ersten 24 Stunden auf 105 mg/L bzw. 48 mg/L. Für die rohen Enzyme der TPL-Konstrukte akkumulierte BHET in 120 Stunden auf 128 mg/L, während MHET in 24 Stunden auf 76,5 mg/L akkumulierte und dann nach 120 Stunden auf 11 mg/L abfiel. Aufgrund der für Enzyme geeigneten Temperatur waren die Aktivitäten der Rohenzyme stärker als die Aktivitäten der gesamten Zellen. Veränderungen in der Oberflächenmorphologie von PET-Membranproben, die mit den Stämmen PPM, MPP, LPT und TPL behandelt wurden, sind in Abb. 4d dargestellt. Im Vergleich zu unbehandeltem PET wurden bei den behandelten Proben unterschiedlich starke Fragmentierungen festgestellt. Beim Abbau der PET-Membran wurde die deutlichste Veränderung in den MPP-Proben beobachtet, die mit der Ansammlung von Abbauprodukten übereinstimmte.

a Kombination von PET-Hydrolasen für den Abbau von Polyethylenterephthalat (PET) in dieser Arbeit: PETase + MHETase oder LCC + Tfca. b Anreicherung der Produkte Mono-(2-hydroxyethyl)-terephthalsäure (MHET) und Bis-(2-hydroxyethyl)-terephthalsäure (BHET) in den gesamten zellabbauenden Systemen der vier manipulierten PET-Stämme. Karten des konstruierten Plasmids sind grau dargestellt. c Anreicherung der Produkte MHET und BHET in den Rohenzymsystemen der vier manipulierten PET-Abbaustämme. d Veränderungen der Oberflächenmorphologie von PET-Membranproben, verifiziert durch ein Rasterkraftmikroskop (AFM) (NANOCUTE II, Seiko Instruments Inc.).

Um eine bessere Anwendung von gentechnisch veränderten Stämmen bei der biologischen Umweltsanierung zu erreichen, ist die Verhinderung des Austretens von gentechnisch veränderten Stämmen für die Umwelt- und ökologische Sicherheit von entscheidender Bedeutung. Das Chitin-bindende Protein GbpA von Vibrio cholerae wurde den manipulierten Vmax-Stämmen (Vmax-cyp168A1p12FdFNR) im pMD18T-Vektor hinzugefügt, was zu Vmax-GbpA-cyp168A1p12FdFNR (VgHBCD) führte. In diesem modifizierten Stamm wurde ein 53-kDa-Protein exprimiert und durch SDS-PAGE nachgewiesen, das dem Molekulargewicht des Proteins GbpA entsprach, und die Adhäsion von VgHBCD an Chitin wurde etwa um das Zweifache verstärkt (Abb. 5a, b). Unter dem Rasterelektronenmikroskop (REM) konnte ein Biofilm auf der Oberfläche von Chitin beobachtet werden (Abb. 5c). Als das VgHBCD-anhaftende Chitinmaterial mit NSS-Puffer gewaschen wurde, um das Wiederherstellungspotenzial zu testen, blieben etwa 80 % des bakteriellen Biofilms auf der Oberfläche des Chitins zurück. Darüber hinaus wurde die HBCD-Abbaufähigkeit von VgHBCD bei Bindung an Chitin nach jedem Waschen nachgewiesen.

a Analyse der Expression des Chitin-bindenden Proteins GbpA mittels SDS-PAGE. M, Proteinmarker; Spur 1–3, Rohenzym, Überstand, Niederschlag des Stammes Vmax; Spur 4–6, Rohenzym, Überstand, Niederschlag des Stammes Vmax-GbpA. b Messung der Biomassebindung an Chitin mit einem 3-(4,5)-Dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-diphenytetrazoliumromide (MTT)-Assay-Kit. Fehlerbalken sind der Standardfehler des Mittelwerts. c Morphologie des bioverankerten Chitins unter dem Rasterelektronenmikroskop (REM) S3400II (Hitachi, Japan) mit einer Beschleunigungsspannung von 20 kV. d–f Überprüfung der Erholungsrate und des Abbaueffekts der Chitin-fixierten Stämme für HBCDs, CP bzw. mPET.

Die HBCD-Abbauraten betrugen 50 % in der ersten Runde und 100 % in der zweiten und dritten Runde (Abb. 5d). Der rekombinante Stamm VgCP, der an Chitin bindet, konnte 100 mg/L Chlorpyrifos bei allen drei Recyclingvorgängen vollständig abbauen (Abb. 5e). Die an Chitin bindenden Stämme VgPPM, VgMPP, VgLPT und VgTPL könnten mPET abbauen, und die angesammelten Produkte BHET und MHET wurden durch HPLC nachgewiesen. In der ersten Runde akkumulierten die Produkte BHET und MHET erheblich, in der zweiten und dritten Runde schwächer (Abb. 5f).

Aufgrund industrieller Aktivitäten sind organisch kontaminierte Umgebungen häufig salzhaltiger und hypersaliner Belastung ausgesetzt. Hohe Salzkonzentrationen (>1 %, w/v) können zu einem Verlust der mikrobiellen Aktivität führen und die enzymatische Aktivität einschränken. Strategien zur Überwindung dieser Probleme umfassen die Anpassung von Bakterien an einen hohen Salzgehalt und den Einsatz von Mikroorganismen mit hoher Salztoleranz. Über den Salzreaktionsmechanismus von V. natriegens liegen nur begrenzte Informationen vor, einschließlich seiner Nützlichkeit als Plattform zum Abbau organischer Schadstoffe.

Die Salzreaktionsmechanismen verschiedener halophiler und halotoleranter Mikroorganismen wurden umfassend erforscht und umfassen den selektiven Transport der anorganischen Ionen Na+/K+ im Zytoplasma zur Anreicherung spezifischer organischer Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Ectoin, Prolin, Betain, Trehalose , Cholin-O-Schwefelsäure und Carnitin. Informationen zur Transkriptionsregulation der Biosynthese beziehen sich überwiegend auf die Biosynthese von Ectoin14. Die meisten der gemeldeten salztoleranten Bakterien könnten kompatible kleine Moleküle absondern, um sich an den Salzstress anzupassen, wie z. B. Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z (NC_016112.1)15, Bacillus halodurans C-125 (BA000004.3)16, Streptomyces coelicolor A3 (AL645882.2). )17, Halomonas elongata HEK1 (FN869568.2)18 und Chromohalobacterium salexigens DSM 3043 (CP000285.1)19. Ectoin-Biosynthesegene (ectABC-Cluster), die sich im Genom der oben genannten Bakterien befinden, werden unter der Kontrolle der salzinduzierten Promotoren neben dem „ATG“-Codon von ectA transkribiert, wie z. B. ectAp1, PectA, PectA, PectA1-4 und PectB und PectA1-4 und PectB. In V. natriegens befand sich der ectABC-Gencluster in entgegengesetzter Richtung neben den Genen des Glycin-Betain/Prolin-Transportsystems und stand unter der Kontrolle von drei Promotoren (ergänzende Abbildung 1). Die Lokalisierung von Genen im Zusammenhang mit Salzstress im Stamm Vmax stellt im Vergleich zu den anderen gemeldeten halophilen oder halotoleranten Mikroorganismen offensichtlich einen ortsspezifischen Vorteil dar. Die Gene, die mit der Na+/K+-Transkription und der Ectoin-, Prolin- und Betain-Biosynthese zusammenhängen, konnten nahezu gleichzeitig zur Expression gebracht werden. Dies führte dazu, dass der geringere Abstand zwischen den beiden Genclustern für die Ectoin-Synthese und den Betain/Prolin-Transport in V. natriegens im Vergleich zu anderen halophilen und halotoleranten Bakterien sowie den empfindlichen Promotoren seine Fähigkeit zur Aufrechterhaltung des osmotischen Gleichgewichts verbesserte.

Angesichts der Notwendigkeit einer biologischen Sanierung in salzbelasteten Umgebungen ist die Verbesserung des Wachstums und der Abbaufähigkeit spezialisierter Bakterien unter Salzstress sinnvoll. Daher ist es von größter Bedeutung, das Potenzial der identifizierten Promotoren für die praktische Anwendung der Bioremediation in organisch kontaminierten Umgebungen mit Salzstress zu bewerten. Dabei wurden drei Degradationsmodelle konstruiert. Chlorpyrifos (CP) ist eines der am häufigsten verwendeten Organophosphor-Pestizide (OP), das neuroverhaltensschädigende Schäden verursacht. Die Abbaurate von Vmax-mpdp12tcpXA (50 mg/L in 24 Stunden) war viel geringer als die des natürlich abbauenden Bakteriums Stenotrophomonas sp. YC-1, das 100 mg/L CP in 18 Stunden abbauen kann. Es ist wahrscheinlich, dass die Expression von Genen unter der Kontrolle von P1 nicht ausreichte, um das erste Produkt, 3, 5, 6-Trichlor-2-pyridinol (TCP), zu metabolisieren20,21. Im zweiten Modell wurden Hexabromcyclododecane (HBCDs), die am zweithäufigsten verwendeten bromierten Flammschutzmittel (BFRs), die in Baumaterialien, Elektronik, Textilien und Kunststoffen zugesetzt werden, als Zielsubstrat ausgewählt. Im Abbauprozess halogenierter organischer Verbindungen ist die anfängliche Dehalogenierung der wichtigste Schritt. Hier war die Abbaurate von HBCDs im Vergleich zum Stamm HS9 um etwa das Zehnfache erhöht, mit einer Abbaurate von 0,64 mg/L über 14 Tage. Die HBCD-Abbaurate von Vmax-cyp168A1p12FdFNR war viel schneller als die Abbaurate von HS922,23. Aufgrund der Effizienz der Elektronenversorgung im salzinduzierten HBCD-Abbaumodell, das das Katalyseenzym CYP168A1 und die elektronenliefernden Enzyme Ferredoxin (Fd) und Ferredoxinreduktase (FNR) enthält, wurde die Abbaurate von HBCDs deutlich erhöht. In der aktuellen Studie wurde der marine Mikroorganismus V. natriegens als Wirt für die Expression von Katalyseenzymen verwendet, deren Wachstum von einem Umweltfaktor (Na+) abhängig ist. Die Verwendung gentechnisch veränderter Bakterien in der Umwelt kann mit einigen Risiken für die Biosicherheit verbunden sein. Sie können sich auf unbefugten Zugriff, Verlust, Diebstahl, Missbrauch, Umleitung oder vorsätzliche Freigabe beziehen. Sollte es zu einem Biosicherheitsunfall kommen, wäre dies eine große Bedrohung für Mensch und Natur24. Unsere Studien tragen dazu bei, die Herausforderungen (unzureichende Robustheit von Laborstämmen, Expression abhängig von chemischen Induktoren) bei der Konstruktion gentechnisch veränderter Bakterien für die Freisetzung in die Umwelt zu bewältigen.

Das Problem der Meeresverschmutzung durch Mikroplastik hat große Aufmerksamkeit erregt und zählt zu den zehn größten neu auftretenden Umweltproblemen weltweit. Aufgrund ihrer geringen Größe (Durchmesser < 5 mm), des breiten Quellenspektrums, der großen Mengen und der Freisetzung von Zusatzstoffen wie Metallen und toxischen organischen Schadstoffen führt dieses Mikroplastik zu einer erheblichen biologischen Toxizität. Plastikmüll ist in Offshore-Gewässern, Meeresgewässern und Sedimenten weit verbreitet und sammelt sich ständig an25. Obwohl viele Arten von PET-Hydrolasen in verschiedenen Mikroorganismen untersucht wurden, darunter Cutinase, Lipase und PETase. Die Anwendung dieser Enzyme auf die Entwicklung von Bakterien, die PET in der Meeresumwelt abbauen, ist begrenzt. Die immobilisierten Zellen können jedoch verbesserte katalytische Aktivitäten aufweisen, die Bioremediationszeit verkürzen, die Produktionskosten senken und die Biosicherheitsrisiken verringern26. In unserer Studie konnten im Modell drei die Stämme PPM, MPP, LPT und TPL PET in 0,5 × NSS abbauen, was darauf hindeutet, dass diese rekombinanten V. natriegens-Stämme in Meeresumgebungen zur biologischen Sanierung der PET-Verschmutzung eingesetzt werden könnten.

Diese Studie trägt dazu bei, viele Bedenken hinsichtlich der geringen Wachstums- und Abbauraten natürlicher Mikroorganismen auszuräumen, die zur biologischen Sanierung unter hohem Salzstress in der Meeresumwelt eingesetzt werden. Marine V. natriegens sollte ein gutes Potenzial für die biologische Sanierung der verschmutzten Meeresumwelt haben.

Chlorpyrifos (CP, ≥99 % Analysequalität), 3,5,6-Trichlor-2-pyridinol (TCP, ≥99 % Analysequalität), Polyethylenterephthalat (PET), Bis-(2-hydroxyethyl)terephthalsäure (BHET) und Mono-(2-hydroxyethyl)terephthalsäure (MHET) wurden von Meryer (Shanghai, China) bezogen. 1, 2, 5, 6, 9, 10-Hexabromcyclododecane (HBCDs, ≥95 % Analysequalität) wurden von Anpel Laboratory Technologies (Shanghai, China) gekauft. Ethylacetat, Methanol und alle anderen in dieser Studie verwendeten Reagenzien und Lösungsmittel waren von analytischer Qualität.

Der V. natriegens-Stamm Vmax wurde von Synthetic Genomic Company (Calipatria, CA) erworben. Pseudomonas aeruginosa HS9 wurde im Laborladen22 bezogen. Das in dieser Arbeit verwendete Minimalsalzmedium (MSM) enthielt (pro Liter) 13,3 g Na2HPO4·12H2O, 4 g KH2PO4, 0,2 g MgSO4, 2,0 g NH4Cl, 9,5 g NaCl und 0,5 ml Spurenelement-Vorratslösung. Die Vorratslösung für Spurenelemente bestand (pro Liter) aus 0,05 g CaCl2·2H2O, 0,05 g CuCl2·2H2O, 0,008 g MnSO4·H2O, 0,004 g FeS·7H2O, 0,1 g ZnSO4, 0,1 g Na2MuO4·2H2O und 0,05 g K2WuO4·2H2O und pH 7,0. Das Nahsalzlösungsmedium (NSS) enthielt (pro Liter) 8,8 g NaCl, 0,735 g Na2SO4, 0,125 g KCl, 0,02 g KBr, 0,935 g MgCl2·6H2O, 0,205 g CaCl2·2H2O, 0,004 g SrCl2·6H2O und 0,004 g H3BO327.

Die transkriptomische Analyse wurde durchgeführt, indem das Transkriptionsprofil der Zellen verglichen wurde, die in Medien mit einer Endkonzentration von 1 und 5 % (Gew./Vol.) NaCl inkubiert wurden. Stamm Vmax wurde in 2-l-Kolben mit 1 l 5 %iger NaCl-Luria-Bertani-Brühe (LB5) kultiviert. Für die Kontrollgruppe wurde der Stamm Vmax in Lysogenie-Brühe (LB) gezüchtet. Alle Proben wurden in thermostatischen Schüttlern bei 30 °C und 200 U/min kultiviert. Die Zellen wurden für die Transkriptomsequenzierung geerntet, als die OD600 0,6–0,8 erreichte, mit flüssigem Stickstoff eingefroren und vor der Sequenzierung bei –80 °C gelagert. Die extrahierte Gesamt-RNA wurde von der DNBSEQ-Plattform (BIG, Shenzhen, China) nachgewiesen. Als Forschungskandidaten wurden Gene mit hohen Transkriptionsniveaus unter einer hohen Salzkonzentration (5 % NaCl) (Up-Regulation Fold Change ≥4) zusammengefasst. Clean-Reads wurden durch das Hierarchical Indexing for Spliced ​​Alignment of Transcripts (HISAT)-Programm 28, 29 mit der Genomsequenz abgeglichen.

Um die Aktivität der vorgeschlagenen Promotoren (vordere 400-bp-Sequenz) zu bestimmen, wurde der Intervallbereich ligiert, um den Vektor pSK8k-mRFP zwischen den PstI- und EcoRI-Stellen zu klonieren. Die Frontsequenzen wurden aus genomischer Vmax-DNA unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 1 beschriebenen Primer amplifiziert. Die gereinigten Fragmente wurden unter Verwendung eines 2 × ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit (Vazyme, Nanjing, China) an lineares pSK8k-mRFP ligiert. Die Regionen, die die Promotoren P1 und P2 enthielten, wurden durch Ligation an pS8K-mRFP weiter verifiziert. Die resultierenden Vektoren wurden durch Elektrotransformation auf den Stamm Vmax übertragen und die kompetenten Zellen wurden wie folgt hergestellt: Stamm Vmax wurde in 3 % LB gezüchtet, die Zellen wurden in thermostatischen Schüttlern bei 30 °C bei 200 U/min kultiviert und geerntet, als die OD600 0,6 erreichte –0,8 wurden die Zellen zweimal mit dem Waschpuffer (7 mM K2HPO3 und 680 mM Saccharose) gewaschen und mit Waschpuffer8 resuspendiert. Die Fluoreszenzintensität von GFP und RFP wurde unter Verwendung eines Multimode-Mikroplattenlesegeräts 20 M (Tecan & Spark, Schweiz) mit Anregung bei 510 nm und Ablesen der Emission bei 485 nm für GFP und mit Anregung bei 607 nm und Ablesen der Emission bei 584 nm bestimmt für RFP30,31. Das Zellwachstum wurde bei 600 nm gemessen. Die Einheitsaktivität der Promotoren wurde wie folgt berechnet:

Die codonoptimierten Gene, die an der Metabolisierung von Chlorpyrifos (CP) beteiligt sind, wurden von der GENEWIZ Company (Suzhou, China) synthetisiert. Die Zugangsnummern der CP-abbauenden Gene mpd, tcpX, tcpA, dhpI und dhpJ waren ABD92793.1, AGC65457.1, AGC65458.1, KC294623.1 (2341–3056) und KC294623.1 (3081–3959). bzw.20,21. Im HBCDs-Abbaumodell wurden das Gen cyp168A1, ein 4Fe-4S-Ferredoxin (Fd) und eine NAD(P)H-abhängige Ferredoxinreduktase (FNR) aus P. aeruginosa HS9 amplifiziert. Die PET-Hydrolasen PETase, MHETase, LCC und Tfca wurden mit den Sequenzen aus den Referenzen32,33,34,35 als Templates von der GENEWIZ Company synthetisiert. Alle verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Die CP/HBCDs-Abbauwege wurden im Klonvektor pAMmcs zwischen EcoRI- und XhoI-Stellen positioniert. Das umgekehrte Gen mpd/cyp168A1 stand unter der Kontrolle des Promotors P2-1, während die anderen Gene (tcpXA-dhpIJ/FdFNR) vom Promotor P1 kontrolliert wurden, was zu pAM-mpdp12tcpXA bzw. pAM-cyp168A1p12FdFNR führte. Die PET-Hydrolasen PETase32, MHETase33, LCC34 und Tfca35 wurden im gleichen Vektor pSK8k wie die Promotoraktivitätsidentifizierung unter der Kontrolle der Promotoren P1 und P2-2 konstruiert.

Nach der Elektrotransformation zum Stamm Vmax wurden einzelne Klone durch PCR verifiziert, wobei Vmax-mpdp12tcpXA, Vmax-cyp168A1p12FdFNR, Vmax-PETaseP122MHETase (PPM), Vmax-MHETaseP122PETase (MPP), Vmax-LCCP122Tfca (LPT) und Vmax-TfcaP122LCC erhalten wurden ( TPL)-Konstrukte. Um ihre Fähigkeit zum Abbau von PET, CP oder HBCDs zu bestimmen, wurden die manipulierten Stämme, die in 5 %iger NaCl-Lysogenie-Brühe (LB5) bis zur logarithmischen Phase gewachsen waren, gesammelt und dreimal mit dem 0,5-fachen NSS-Medium gewaschen und mit 0,5-fachem NSS resuspendiert. Die endgültige optische Dichte wurde auf einen OD600 von 1,0 eingestellt. Ein Gramm PET (enthaltend 0,5 g Mikro-PET und 0,5 g PET-Membran), 100 mg/L CP oder 1 mg/L HBCDs wurden zu 20 ml des Zelllysats als Substrat hinzugefügt, alle Reaktionen wurden separat durchgeführt bei 30 °C durchgeführt. Alle 2 Tage wurde ein ml Reaktionsgemisch aus dem Reaktionssystem extrahiert. Um die Reaktion zu beenden, wurde den Proben Salzsäure (1 %) zugesetzt. Alle Proben wurden bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert und für jeden einzelnen Punkt wurden drei biologisch unabhängige Proben nachgewiesen36,37. Für die Rohenzymaktivitätstests wurde die resuspendierte Zellsuspension mit einem Hochdruckhomogenisator (APV-2000, Deutschland) bei 4 °C aufgebrochen und anschließend wurden die Zelltrümmer durch 40-minütige Zentrifugation bei 10.000 U/min entfernt. Ein Gramm PET wurde zu 20 ml des Überstands als Substrat gegeben und die Reaktion mit PPM-, MPP-, LPT- und TPL-Konstrukten wurde mit den Thermostatschüttlern bei 44 °C bzw. 55 °C durchgeführt. Außerdem wurde alle 2 Stunden 1 ml Reaktionsgemisch aus dem Reaktionssystem extrahiert, die Proben wurden mit den gleichen Methoden wie die Proben zum Abbau ganzer Zellen vorbereitet und nachgewiesen.

Die Immobilisierung der manipulierten Vmax-Stämme auf Chitin wurde durchgeführt, um eine biologische Leckage zu vermeiden und ein kontinuierliches Recycling der abbauenden Mikroressource zu ermöglichen38,39. Das Gen (Zugangsnummer CP047296.1, 755825–757282), das für das Chitin-Bindungsprotein GbpA kodiert, wurde aus Vibrio cholerae40,41 mit dem Primer GbpAF: 5'-ATGAAAAAACAACCT-3', GbpAR: 5'-TTAACGTTTATCCCACG-3' amplifiziert. Das amplifizierte Produkt wurde in den pMD18T-Blunt-Vektor (TransGen Biotech, China) ligiert und dann in E. coli Top1042 transformiert. Die Transformanten wurden nach der Plasmidextraktion mit den Universalprimern M13F-GbpAF oder M13R-GbpAR sequenziert. Der resultierende Vektor, pMD18T-GbpA, wurde auf die Stämme Vmax-mpdp12tcpXA, Vmax-cyp168A1p12FdFNR, Vmax-PETaseP122MHETase (PPM), Vmax-MHETaseP122PETase (MPP), Vmax-LCCP122Tfca (LPT) bzw. Vmax-TfcaP122LCC (TPL) übertragen , bildend Vmax-GbpA-mpdp12tcpXA (VgCP), Vmax-GbpA-cyp168A1p12FdFNR (VgHBCD), Vmax-GbpA-PETaseP122MHETase (VgPPM), Vmax-GbpA-MHETaseP122PETase (VgMPP), Vmax-GbpA-LCCP122Tfca (Vg LPT) und Vmax- GbpA-TfcaP122LCC (VgTPL)-Konstrukte.

Die gentechnisch veränderten Vg-Stämme wurden in LB5 bis zur logarithmischen Phase gezüchtet, gesammelt und dreimal mit dem NSS-Medium gewaschen. Anschließend wurden 2 ml Zellpellet mit 350 ml NSS, ergänzt mit 100 mg/L CP, 10 mg/L HBCDs und 0,1 g Mikro-PET (mPET), resuspendiert. Die resultierende Suspension wurde zu 0,3 g sterilisiertem Chitin (CAS: 1398-61-4) (Sigma-Aldrich, Amerika) in einer 5-ml-Glasflasche gegeben, wobei 1 ml 0,5 × NSS-Puffer zum Reaktionssystem gegeben wurde. Die Bindungsreaktion wurde 3 Tage lang stationär bei 30 °C inkubiert. Um die Effizienz recycelter Bakterien zu testen, wurde der erzeugte HBCD-abbauende Stamm als Modul verwendet, um die verbleibenden HBCD-Raten dreimal zu berechnen, indem die verbleibenden HBCD-Konzentrationen ermittelt wurden. Die festen Chitin-bindenden Bakterien wurden dreimal mit dem NSS-Medium zur Wiederverwendung gewaschen (Zentrifugation bei 3000 U/min für 2 Minuten). Aufgrund der Funktion des Chitin-bindenden Proteins GbpA wurde die Effizienz der Bindung von gentechnisch veränderten Vg-Stämmen an Chitin erhöht. Die Biomassebindung an Chitin wurde mit einem (3-(4,5)-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Testkit gemessen. Der Stamm wurde inkubiert und mit 100 μl MTT (5 g/l) versetzt und 4 bis 5 Stunden lang im Dunkeln gehalten. Anschließend wurden 100 μl DMSO hinzugefügt und bei 570 nm abgelesen. Der Sterblichkeitsprozentsatz wurde berechnet43. Die Konzentrationen der zugesetzten Substrate wurden mit der gleichen Methode wie in Abschnitt 2.5 ermittelt.

Proben für den CP- und HBCD-Abbau wurden vorbereitet, indem zunächst NaCl im Überschuss zu den gelagerten Proben gegeben wurde. Anschließend wurde Ethylacetat in einem Volumenverhältnis von 1:1 zugegeben, um das Substrat zu extrahieren. Anschließend wurde die Mischung 30 Sekunden lang mit einem Vortex-Oszillator (YETO, Vortex-2, China) verwirbelt und anschließend 5 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert. Zur Detektion wurde die organische Phase verwendet. Proben für den PET-Abbau wurden durch Zugabe von 20 % Dimethylsulfoxid (DMSO) vorbereitet und anschließend wie bei den CP- und HBCD-Proben extrahiert. Die Konzentration und Zwischenmetaboliten von CP wurden durch Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) (Agilent & GC-7890B; MS-5977B) nachgewiesen. Die organische Phase wurde vor der Injektion 30 Minuten lang mit einem gleichen Volumen BSTFA bei 70 °C inkubiert44.

HBCDs wurden durch Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (UPLC-TOF/MS) quantifiziert, ausgestattet mit einer Eclipse XDB C18-Analysesäule (5 μm, 4,6 × 150 μm, Keystone Scientific, Agilent). Für die Zielverbindungen wurde eine mobile Phase aus Wasser und Methanol mit einer Flussrate von 0,25 ml/min angewendet. Der proportionale Gradient der mobilen Phase wurde bei 95 % Methanol gestartet und über 25 Minuten linear auf 100 % erhöht, dann sofort auf 95 % abgesenkt und 10 Minuten lang gehalten. Für die massenspektrometrische Analyse wurde die Ionisationsquelle im Negativmodus betrieben und die MS-Detektion auf m/z 0 bis 1.700 eingestellt. Alle Zielverbindungen wurden basierend auf ihren Wasserstoffadduktionen [M + H]− bei m/z und der Charakterisierung des Bromisotops extrahiert.

Bis-(2-hydroxyethyl)terephthalsäure (BHET) und Mono-(2-hydroxyethyl)terephthalsäure (MHET) wurden durch Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) quantifiziert, ausgestattet mit einer Eclipse XDB C18-Analysesäule (5 μm, 4,6 ×). 150 μm, Keystone Scientific, Agilent). Für die Zielverbindungen wurde eine mobile Phase aus Wasser mit 0,1 % Ameisensäure und Methanol mit einer Flussrate von 0,8 ml/min angewendet. Der proportionale Gradient der mobilen Phase wurde bei 5 % Methanol gestartet und über 12 Minuten linear auf 44 % erhöht, dann über 3 Minuten linear auf 70 % erhöht und weitere 3 Minuten gehalten, bevor er sofort zu 5 % Methanol zurückkehrte.

Die Morphologie des bioverankerten Chitins wurde mit dem Rasterelektronenmikroskop (REM) S3400II (Hitachi, Japan) mit einer Beschleunigungsspannung von 20 kV beobachtet und analysiert. Nach der Beschichtung mit Gold wurden alle Proben auf die REM-Probenplatte geklebt und separat beobachtet. Veränderungen im Aussehen von PET-Membranoberflächen wurden mit einem Rasterkraftmikroskop (AFM) (NANOCUTE II, Seiko Instruments Inc.) mit einer durchschnittlichen Größe von 10 nm gemessen. Die PET-Proben wurden dreimal mit destilliertem Wasser und dann zweimal mit Ethanol gewaschen.

Alle Tests wurden doppelt durchgeführt und in mindestens drei unabhängigen Experimenten wiederholt. Konzentrations-Abbau-Kurven wurden mit der Software GraphPad Prism 8.0 erstellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und seiner Zusatzinformationsdatei (Ergänzungsabbildung 1 und Ergänzungstabellen 1–3) verfügbar. Zusätzliche Informationen, relevante Daten und einzigartige biologische Materialien sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium (2021YFA0909500) des National Key R&D Program of China, durch das Stipendium (32030004) der National Natural Science Foundation of China, durch das Stipendium (20XD1421900) des Shanghai Excellent Academic Leaders Program und durch das Stipendium ( 17SG09) des Shuguang-Programms der Shanghai Education Development Foundation und der Shanghai Municipal Education Commission.

Staatliches Schlüssellabor für mikrobiellen Stoffwechsel und School of Life Sciences & Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, VR China

Ling Huang, Jun Ni, Ping Xu und Hongzhi Tang

CAS Key Laboratory of Quantitative Engineering Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Synthetic Genomics und Shenzhen Key Laboratory of Synthetic Genomics, Shenzhen Institute of Synthetic Biology, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shenzhen, VR China

Chao Zhong und Junbiao Dai

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LH und HT konzipierten und gestalteten Experimente. LH führte Experimente durch. HT und PX erhielten Projekte und steuerten Reagenzien und Materialien bei. LH und HT haben den Artikel geschrieben. LH, JN, HT, CZ, JD und PX diskutierten und überarbeiteten das Manuskript. Alle Autoren kommentierten das Manuskript vor der Einreichung. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Jun Ni oder Hongzhi Tang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Hendrik Ballerstedt und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Gene Chong. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Huang, L., Ni, J., Zhong, C. et al. Aufbau einer salzinduzierten Bioremediationsplattform aus marinem Vibrio natriegens. Commun Biol 5, 1352 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04319-3

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Eingegangen: 20. Juni 2022

Angenommen: 29. November 2022

Veröffentlicht: 09. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04319-3

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