Entwicklung mikrobieller Gemeinschaften in Biofilm und Belebtschlamm in einem Hybridreaktor

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 12558 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Mikroorganismen spielen eine Schlüsselrolle in der biologischen Abwasserreinigung. Die Form, in der sich Biomasse entwickelt, bestimmt aufgrund unterschiedlicher Bedingungen in verschiedenen mikrobiellen Strukturen die Effizienz und die Mechanismen der Umwandlung organischer Verbindungen. Die Ergebnisse von Studien zum Vergleich der mikrobiellen Gemeinschaften in Biofilm und Belebtschlamm waren jedoch häufig widersprüchlich. Daher verglich diese Studie die Zusammensetzung und Entwicklung der Bakteriengemeinschaften in Biofilm und Belebtschlamm in einem Hybridreaktor unter Verwendung von 16S-rRNA-Sequenzierung. Die statistische Analyse der Sequenzierungsdaten umfasste die Identifizierung von Taxa, die für den Biofilm und den Belebtschlamm charakteristisch sind, eine Alpha- und Beta-Diversitätsanalyse sowie eine Netzwerkanalyse. Diese Analysen zeigten, dass die Bakteriengemeinschaft des Biofilms reicher und vielfältiger war als die Belebtschlammgemeinschaft. Die mittlere Anzahl der OTU betrug 1614 im Biofilm und 993 im Belebtschlamm, und die Mittelwerte der Biodiversitätsindizes Chao1 (1735 vs. 1105) und Shannon (5,3 vs. 4,3) waren für den Biofilm signifikant höher. Der Biofilm war eine bessere Umgebung für die Entwicklung von Nitrifikanten (z. B. Nitrosomonas, Nitrospira) und Phosphor akkumulierenden Organismen (Candidatus Accumulibacter). Bakterien im Biofilm-Koexistenznetzwerk hatten mehr Verbindungen (basierend auf dem Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman) untereinander, was darauf hindeutet, dass sie stärker interagieren als diejenigen im Belebtschlamm.

Hybride biologische Reaktoren, die das Wachstum von Mikroorganismen in Belebtschlamm und im Biofilm kombinieren, werden in verschiedenen Konfigurationen häufig in der Abwasserbehandlung eingesetzt. Bei der gängigsten Art von Hybridbioreaktoren entwickelt sich der Biofilm auf beweglichen Trägern, die einem Belebungsbecken hinzugefügt werden. Es gibt jedoch auch Systeme mit anderen technologischen Lösungen wie einem rotierenden biologischen Kontaktor oder einem Tauchbett. Durch den Einsatz von Bioreaktoren auf Basis der Hybridtechnologie kann die Konzentration der Biomasse erhöht und die Effizienz der Abwasserbehandlung verbessert werden. Ein Beispiel für diese Art von Technologie ist der integrierte Festfilm-Aktivschlamm-Bewegungsbett-Sequenzierungs-Batch-Biofilmreaktor (IFAS-MBSBBR), der eine Modifikation der herkömmlichen Sequenzierungs-Batch-Reaktortechnologie darstellt. In diesem Reaktor existieren beide Arten von Biomasse nebeneinander im selben Tank. Die Hauptvorteile dieser Technologie sind die Vermeidung von Schlammaufblähungen und die Möglichkeit, eine größere Ladung an Schadstoffen aufzunehmen1.

Unabhängig von der verwendeten technologischen Lösung spielen Mikroorganismen eine Schlüsselrolle in der biologischen Abwasserreinigung. Die Bildung der mikrobiellen Gemeinschaft wird von vielen Faktoren beeinflusst, darunter den Betriebsbedingungen und der Zusammensetzung des zulaufenden Abwassers2. Ein wichtiger Faktor, der die Effizienz der Schadstoffentfernung und die Leistung des gesamten Prozesses beeinflusst, ist das Schlammalter. Das Schlammalter, auch Feststoffverweilzeit (SRT) genannt, ist die Zeit, die die Feststofffraktion (Bakterien) im Reaktor verbringt. Jede Bakteriengruppe hat eine andere optimale Vermehrungszeit und eine zu kurze SRT führt dazu, dass sie aus dem System ausgewaschen werden. Die Anforderungen verschiedener Bakterien an die für die Vermehrung benötigte Zeit sind sehr unterschiedlich: Eine lange SRT begünstigt die Entwicklung von nitrifizierenden und filamentösen Bakterien, während eine kurze SRT Phosphor akkumulierende Bakterien begünstigt und denitrifiziert3,4,5. Auch die Form, in der sich Biomasse entwickelt hat einen wesentlichen Einfluss auf die endgültige Struktur der mikrobiellen Gemeinschaft. Im Biofilm herrschen andere Bedingungen als im Belebtschlamm: Im Biofilm herrschen beispielsweise Konzentrationsgradienten von Sauerstoff und Nährstoffen, und von diesen Stoffen gelangt weniger in die tieferen Schichten des Biofilms. Daher verfügen Belebtschlamm und Biofilm über unterschiedliche Mechanismen zur Schadstoffentfernung6. Eine optimale Dicke des Biofilms ist entscheidend für die Leistung von Abwasserbehandlungsprozessen. Wenn es zu dünn ist, bietet es keine anoxischen Bedingungen für die Vermehrung denitrifizierender Bakterien; Ist sie zu dick, ist sie für nitrifizierende Bakterien ungünstig, da sie als Barriere wirkt und den Zugang zu Nährstoffen einschränkt7. Die Form einer mikrobiellen Gemeinschaft wird auch durch ihren Entwicklungsstand bestimmt. Sowohl im Belebtschlamm als auch im Biofilm verändern sich die Anteile einzelner Bakteriengruppen mit fortschreitendem Reifungsprozess.

Fortschritte in den molekularen Techniken und der Sequenzierung der nächsten Generation haben die Untersuchung komplexer Bakteriengemeinschaften in Abwasseraufbereitungssystemen erleichtert. Einer der am häufigsten verwendeten Ansätze in umweltmikrobiologischen Studien ist die Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens. Durch den Vergleich der erhaltenen Sequenzen mit Sequenzen, die in umfangreichen Datenbanken verfügbar sind, ist es möglich, in Umweltproben vorhandene Bakterien zu identifizieren. Die 16S-rRNA-Gensequenzierung generiert eine große Menge an Informationen über die gesamte mikrobielle Gemeinschaft und ermöglicht die Definition ihrer taxonomischen Zusammensetzung. Dieser Ansatz liefert jedoch keine Informationen über die aktiven Gene und Stoffwechselwege. Um die Genexpression zu untersuchen und ein funktionelles Profil der mikrobiellen Gemeinschaft zu erstellen, ist daher der Einsatz von RNA-basierten Methoden wie der Metatranskriptomik erforderlich. Die 16S-rRNA-Gensequenzierung ermöglicht die Abschätzung der Häufigkeit von Mikroorganismen, die eine bestimmte Gemeinschaft bilden, kann jedoch keine Informationen über die Beziehungen zwischen ihren Mitgliedern oder die Faktoren liefern, die ihre Entwicklung beeinflussen8. Eine Methode zur Untersuchung der Interaktionen zwischen Mikroorganismen besteht darin, ein Netzwerk zu schaffen, das die untersuchte Gemeinschaft repräsentiert und eine umfassende Analyse ermöglicht. Die Knoten in solchen Netzwerken symbolisieren operative taxonomische Einheiten (OTU). Die Knoten sind durch Kanten miteinander verbunden, die die Wechselwirkungen zwischen ihnen darstellen (meist eine Korrelation im Überfluss). Die Visualisierung und Analyse der Netzwerke ermöglicht die Bestimmung der wichtigsten Taxa in den untersuchten Gemeinschaften sowie potenziell voneinander abhängiger oder potenziell miteinander konkurrierender Taxa.

Derzeit wurden mehrere Studien zum Vergleich von Biofilm- und Belebtschlammgemeinschaften veröffentlicht, die Ergebnisse dieser Studien sind jedoch häufig widersprüchlich. Beispielsweise wurde in einigen Studien festgestellt, dass der Biofilm und die Bakteriengemeinschaften im Belebtschlamm ähnlich sind, insbesondere in reifen Formen der Biomasse9. Andere Studien deuten jedoch auf die Existenz erheblicher Unterschiede in der Struktur dieser beiden Umgebungen hin10,11. In Studien von Jo et al.12 wurde festgestellt, dass bestimmte Gruppen von Bakterien in beiden Formen der Biomasse häufig vorkommen, während es erhebliche Unterschiede in ihrer Häufigkeit sowie in den Interaktionen zwischen Gemeinschaftsmitgliedern gibt, was sich in Unterschieden in zeigte topologische Merkmale des Netzwerks. Daher besteht Bedarf an einer eingehenderen Untersuchung dieser Mikrobiome, insbesondere ihrer metabolischen Spezialisierung auf die Abwasserbehandlung und der Unterschiede in ihrer Entwicklung und Reaktion auf sich ändernde Umweltbedingungen, z. B. Belüftungsstrategien, sowie Unterschiede in den Interaktionen zwischen Gemeinschaftsmitgliedern . Ziel dieser Arbeit war es daher, die Strukturunterschiede zwischen der mikrobiellen Gemeinschaft im Biofilm und der Gemeinschaft im Belebtschlamm eines Hybridreaktors zu charakterisieren, der kommunales Abwasser unter Verwendung unterschiedlicher Belüftungsstrategien behandelt. Die Rolle bestimmter Bakterienarten bei der Umwandlung organischer Verbindungen im untersuchten Reaktor wird diskutiert. Das Experiment wurde über einen langen Zeitraum durchgeführt, wodurch die beiden Biomasseformen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien untersucht und verglichen werden konnten. Wir verwendeten einen Ansatz, der eine Kombination aus 16S-rRNA-Sequenzierung und Analyse von Netzwerken zum gleichzeitigen Vorkommen von Mikroorganismen beinhaltete. Die Sequenzierungstechnik lieferte Informationen über die mikrobielle Zusammensetzung der Gemeinschaften im Biofilm und im Belebtschlamm. Das zweite Ziel dieser Studie bestand darin, Einblicke in die ökologischen Beziehungen zwischen Mitgliedern dieser Gemeinschaften zu gewinnen. Dies erforderte eine statistische Analyse der gewonnenen Daten und die Erstellung von Korrelationsmatrizen zur Quantifizierung des gemeinsamen Vorkommens einzelner Mikroorganismengruppen. Basierend auf den Korrelationsmatrizen wurden Koexistenznetzwerke für die am stärksten korrelierten Taxa erstellt. Die Vorteile dieses Ansatzes bestehen nicht nur darin, dass die taxonomische Zusammensetzung der untersuchten Umgebung definiert wurde, sondern auch darin, dass die Gruppen von Mikroorganismen bestimmt wurden, die am häufigsten koexistieren und miteinander interagieren. Somit liefert diese Studie neue Informationen über die Ökologie von Bakterien in Abwasseraufbereitungssystemen und wird dazu beitragen, ein Verständnis für die Beziehungen zwischen Bakterien zu entwickeln, die an der Umwandlung von Abwasserverbindungen beteiligt sind. Die Erweiterung des Wissens über diese Bakterien wird eine bessere Steuerung der Schadstoffentfernungsprozesse in Abwasseraufbereitungssystemen ermöglichen.

Um die mikrobielle Struktur des im IFAS-MBSBBR-Reaktor entstehenden Biofilms und Belebtschlamms zu untersuchen, wurden während eines 573-tägigen Experiments in regelmäßigen Abständen insgesamt 15 Proben entnommen. Das Mikrobiom beider Umgebungen wurde auf Stamm- und Gattungsebene beschrieben. Insgesamt wurden 26 Bakterienstämme und 783 Bakteriengattungen identifiziert. Die zahlreichsten Phyla und Gattungen in den Biofilm- und Belebtschlammproben sind in den Abbildungen dargestellt. 1 und 2. Sowohl im Biofilm als auch im Belebtschlamm waren die zahlreichsten Phyla Proteobakterien mit entsprechenden mittleren Häufigkeiten von 39,3 % ± 9,0 bzw. 40,8 % ± 8,2 und Bacteroidota mit jeweiligen mittleren Häufigkeiten von 14,2 % ± 4,9 bzw. 26,1 %. ± 13,7. Darüber hinaus kam der Stamm Chloroflexi im Biofilm ziemlich häufig vor (mit einer mittleren Häufigkeit von 13,9 ± 8,1), während Actinobacteriota und Patescibacteria im Belebtschlamm relativ häufig vorkamen (mit einer mittleren Häufigkeit von 9,0 % ± 9,6 bzw. 7,5 % ± 8,1). . Die STAMP-Analyse ergab eine signifikante Überrepräsentation von Chloroflexi, Acidobacteriota und Nitrospirota im Biofilm und von Firmicutes im Belebtschlamm.

Relative Häufigkeit (%) der am häufigsten vorkommenden Phyla in den Biofilm- und Belebtschlammproben im Allgemeinen, als Mittelwerte der relativen Häufigkeit aller Biofilm- und Belebtschlammproben (A) und in jeder einzelnen Probe (B). Die Grafik zeigt nur Phyla, die in mindestens einer Probe mehr als 0,5 % zur gesamten Bakteriengemeinschaft beitrugen. Die Häufigkeit der verbleibenden Phyla wurde summiert und als „andere“ gekennzeichnet.

Relative Häufigkeit (%) der häufigsten Gattungen in den Biofilm- und Belebtschlammproben im Allgemeinen, als Mittelwerte der relativen Häufigkeit aller Biofilm- und Belebtschlammproben (A) und in jeder einzelnen Probe (B). Die Grafik zeigt nur Gattungen, die in mindestens einer Probe mehr als 1,5 % zur gesamten Bakteriengemeinschaft beitrugen. Die Häufigkeit der übrigen Gattungen wurde zusammengefasst und als „andere“ bezeichnet.

In beiden Umgebungen veränderte sich die Häufigkeit verschiedener Bakteriengruppen im Laufe der Zeit. Im Biofilm nahm die Häufigkeit von Proteobakterien und Actinobakterien allmählich ab, während die von Chloroflexi zunahm. Im Belebtschlamm waren die Veränderungen in der Häufigkeit größer und schneller, und die Häufigkeit von Bacteroidota veränderte sich am stärksten und reichte von 12,7 % nach 42 Tagen Reaktorbetrieb bis zu 52,3 % nach 110 Tagen, als Bacteroidota der vorherrschende Stamm war. Auch die Häufigkeit der Patescibakterien veränderte sich erheblich: Die Häufigkeit war am 78., 205. und 447. Tag des Prozesses am höchsten und erreichte Werte von 20,1 %, 11,0 % bzw. 7,2 %. Ähnliche Veränderungen fanden bei der Häufigkeit von Armatimonadota statt, die am 547. und 573. Tag 11,4 % bzw. 7,6 % erreichte, in den zu anderen Zeitpunkten entnommenen Proben jedoch 0,1 % nicht überstieg.

Auf Gattungsebene stellten die weniger häufig vorkommenden Gattungen (jeweils < 1,5 % der gesamten Bakteriengemeinschaft) zusammen den größten Anteil an allen Proben von Biofilm- und Belebtschlammproben dar (durchschnittliche Häufigkeit von 45,6 % ± 5,8 bzw. 30,5 % ± 6,0). ). Ornithinibacter kam anfangs relativ häufig im Biofilm vor, was der Grund für die relativ große mittlere Häufigkeit von 4,3 % ± 5,3 % ist. Im Laufe der Zeit nahm die Häufigkeit dieser Gruppe jedoch erheblich ab und betrug am Ende des Prozesses nur noch 0,3 %. Ebenso betrug die Häufigkeit von Rhizorhapis in der ersten Probe 13,92 %, nahm dann aber ab und diese Gattung wurde nach dem 205. Tag nicht mehr nachgewiesen. Bemerkenswert sind auch die Veränderungen in der Häufigkeit von Nitrospira und Candidatus Competibacter, die zunächst zunimmt und dann abnimmt. Nitrospira war in der Probe ab dem 447. Tag (5,7 %) am häufigsten und Candidatus Competibacter in der Probe ab dem 110. Tag (6,4 %). Die Häufigkeit der übrigen Gattungen überschritt zu keinem Zeitpunkt dieser Studie 5 %.

Auch in den Belebtschlammproben nahm die Häufigkeit von Ornithinibacter zu Beginn des Versuchs deutlich ab (von 23,0 % in der ersten Probe und 12,5 % am 78. Tag auf Werte unter 3 % in den Folgezeiträumen). Im Allgemeinen veränderten sich die Häufigkeiten einzelner Gattungen im Belebtschlamm schneller als im Biofilm. Auch in den folgenden Zeiträumen kam es zu einem raschen Rückgang und Anstieg der Häufigkeit vieler Bakteriengruppen, insbesondere bei nicht kultivierten Saccharimonadales und Zoogloea. Abbildung 3 zeigt Bakteriengruppen, die sich deutlich zwischen Biofilm- und Schlammproben unterschieden. Denitratisoma, Nitrospira, Candidatus Competibacter, Dechlorosoma, Candidatus Accumulibactrer und Kouleothrix kamen im Biofilm deutlich häufiger vor als in der Biomasse, während Zooglea, unkultivierte Saccharimonadales, Rhodobacter und Ottowia im Biofilm deutlich seltener vorkamen.

Mittlere Anteile mikrobieller Phyla (A) und Gattungen (B), die sich deutlich zwischen Biofilm- (rot) und Schlammproben (blau) unterschieden. Die Diagramme wurden mit der STAMP-Software (Statistical Analysis of Metagenomic Profiles) erstellt. P-Werte und Konfidenzintervalle wurden mit dem nichtparametrischen T-Test von White berechnet.

Die Indizes der Bakteriengemeinschaft wurden mithilfe der EZBioCloud-Plattform geschätzt (Tabelle 1). Die durchschnittliche Good-Abdeckung aller Proben betrug 99,75 % ± 0,047 %, was darauf hinweist, dass die Sequenzierungsabdeckung sehr hoch war. Die Gesamtzahl der OTUs unterschied sich je nach Probe und Biomasseart. Die mittlere Anzahl der OTUs betrug 1614 ± 141 für Biofilm und 993 ± 109 für Belebtschlamm. Der Chao1-Index wurde verwendet, um den Gemeinschaftsreichtum zu bewerten, dh die Anzahl der Arten im Biofilm und in den Belebtschlammgemeinschaften, und der Shannon-Index wurde verwendet, um die Gemeinschaftsvielfalt zu messen, wobei sowohl die Häufigkeit als auch die Gleichmäßigkeit der Arten berücksichtigt wurden. Die Mittelwerte dieser Indizes zeigten, dass die Biofilmgemeinschaft reicher und vielfältiger war als die Belebtschlammgemeinschaft (Chao1: 1734,64 ± 138,59 vs. 1105,72 ± 138,59; Shannon: 5,34 ± 0,23 vs. 4,27 ± 0,41). Die Unterschiede zwischen den Gemeinschaften waren alle statistisch signifikant (P < 0,05).

Abbildung 4 zeigt die Ergebnisse der Beta-Diversitätsanalyse basierend auf der Bray-Curtis-Unähnlichkeit. Die Hauptkoordinatenanalyse zeigte, dass sich die Biofilm- und Belebtschlammproben in zwei separate Cluster gruppierten, obwohl die Abstände zwischen den einzelnen Proben recht groß waren. Die hierarchische Analyse ergab, dass die Entwicklung von Biofilm und Belebtschlamm unabhängig voneinander war, und bestätigte den Abstand der Unterschiede zwischen diesen beiden Arten von Biomasse.

Hierarchische Clusterbildung und Hauptkoordinatenanalysediagramm von Biofilm- (B) und Schlammproben (S).

Um Wechselwirkungen und Beziehungen zwischen Bakterien im Biofilm und Belebtschlamm zu modellieren, wurde die Netzwerkanalyse des gleichzeitigen Vorkommens eingesetzt. In der vorliegenden Studie wurden zwei Netzwerke erstellt, die das gleichzeitige Vorkommen von Gattungen im Biofilm und im Belebtschlamm darstellen. In Abb. In 5 und 6 basiert die Farbe jedes Knotens auf seinem Modularitätsklassenparameter und seine Größe auf seiner Betweenness-Zentralität. Die grundlegenden Parameter, die beide Netzwerke charakterisieren, sind in Tabelle S1 aufgeführt. Im Allgemeinen wies das Biofilm-Netzwerk mehr Verbindungen zwischen den Knoten auf als das Belebtschlamm-Netzwerk, und der Abstand zwischen den Knoten war im Biofilm-Netzwerk kleiner, was darauf hindeutet, dass die Mikroorganismen, die den Biofilm erzeugen, enger miteinander verbunden sind und mehr Beziehungen zwischen ihnen haben. Beide Netzwerke hatten die gleiche Anzahl an Knoten (83), aber das Biofilm-Netzwerk hatte mehr Kanten (Verbindungen zwischen Knoten, die das gleichzeitige Auftreten symbolisieren). In beiden Netzwerken war die Zahl der positiven Assoziationen etwas höher als die der negativen Assoziationen und machte 55 % der Gesamtzahl der Verbindungen aus. Der mittlere Clusterkoeffizient (dh das Verhältnis zwischen der beobachteten und der maximal möglichen Anzahl von Verbindungen zwischen einem Knoten und seinen Nachbarn) war für den Biofilm höher als für den Belebtschlamm (0,556 vs. 0,432). Ebenso war die Netzwerkdichte, also das Verhältnis zwischen der beobachteten Anzahl Kanten und der maximal möglichen Anzahl davon, beim Biofilm höher (0,073 vs. 0,05). Der Netzwerkdurchmesser (der Abstand zwischen den beiden am weitesten entfernten Knoten) war beim Biofilm kürzer als bei der Biomasse (6 vs. 7). Ebenso war die durchschnittliche Pfadlänge, also die Anzahl der Kanten auf dem kürzesten Pfad zwischen Knotenpaaren, im Biofilmnetzwerk kürzer als im Belebtschlammnetzwerk (1,984 vs. 2,241). Der mittlere Knotengrad (die Anzahl der Kanten zwischen einem Knoten und anderen Knoten im Netzwerk) war im Biofilmnetzwerk größer als im Belebtschlammnetzwerk (6,012 vs. 4,12). Der Knotengrad lag im Biofilmnetzwerk zwischen 1 und 31 und im Belebtschlammnetzwerk zwischen 1 und 23. Im Biofilmnetzwerk gab es vier Knoten mit den höchsten Graden (≥ 30), die als Hub-Knoten betrachtet werden können: Diaphorobacter, Rhizorapis, Mesorhizobium und Pseudoxanthomonas. Diese Mikroorganismen hatten 61,5 % positive und 38,5 % negative Verbindungen mit anderen Mikroorganismen. Obwohl die Häufigkeit von Mesorhizobium und Pseudoxanthomonas gering war (nicht mehr als 1,5 % der gesamten Bakteriengemeinschaft in jeder Probe), zeigten sie interessanterweise positive Assoziationen mit sehr häufig vorkommenden Bakterien, z. B. Ornithinibacter. Das Belebtschlammnetzwerk hatte außerdem 4 Knotenpunkte (mit Knotengrad ≥ 20): Nocardioides, Gemmatimonas, Leptothrix und Rhizorhapis. Diese Hub-Knoten waren durch ähnliche Mengen an positiven und negativen Kanten mit anderen Knoten verbunden (51,8 % bzw. 48,2 %). Die Größe der Knoten in den erstellten Netzwerken ist proportional zu ihrer Betweenness-Zentralität (ein Parameter, der die Häufigkeit des Auftretens eines bestimmten Knotens auf den Pfaden zwischen zwei anderen Knoten angibt). Hohe Werte der Betweenness-Zentralität zeigen an, dass ein Knoten einen zentralen Standort in einem Netzwerk hat, während niedrige Werte darauf hinweisen, dass er einen peripheren Standort hat13. Mikroorganismen mit hoher Betweenness-Zentralität spielen eine Schlüsselrolle und fungieren als Brücken zwischen anderen Bakterien im Netzwerk. Im Biofilm-Netzwerk wiesen Paracoccus, Phaeodactylibacter und Pseudoxanthomonas die höchsten Werte der Betweenness-Zentralität auf, während im Belebtschlamm-Netzwerk Dongia, Diaphorobacter und Rhizorhapis die höchsten Werte aufwiesen.

Netzwerk des Biofilm-Mikrobioms mit Knoten, die Taxa auf Gattungsebene oder Effizienzen der Schadstoffentfernung darstellen, und Kanten, die Korrelationen darstellen (grüne Kanten – positive Korrelation; rote Kanten – negative Korrelation).

Netzwerk des Belebtschlamm-Mikrobioms mit Knoten, die Taxa auf Gattungsebene oder Effizienzen der Schadstoffentfernung darstellen, und Kanten, die Korrelationen darstellen (grüne Kanten – positive Korrelation, rote Kanten – negative Korrelation).

Die Netzwerke wurden mit zusätzlichen Knotenpunkten aufgebaut, die die Effizienz von Schadstoffentfernungsprozessen darstellen, d. h. Entfernung organischer Verbindungen und Phosphorverbindungen sowie Denitrifikation, Ammonifikation und Nitrifikation. Im Biofilm-Netzwerk hatten die Effizienzen der Entfernung von Phosphorverbindungen und der Nitrifikation die meisten Assoziationen mit mikrobiellen Knoten (9 positive und 2 negative bzw. 6 positive und 4 negative). Die Effizienz der Phosphorentfernung war positiv mit der Häufigkeit von Candidatus Accumulibacter, Dechlorosoma, Thauera und unkultivierten Saccharimonadales verbunden, während die Nitrifikation positiv mit der Häufigkeit von Taxa wie Nitrosomonas, Sphingomonas und Thermomonas assoziiert war. Die verbleibenden Wirkungsgrade der Schadstoffentfernung hatten keine oder nur 1–2 Verbindungen mit mikrobiellen Knoten. Im Belebtschlamm-Netzwerk hingegen waren alle Effizienzknoten mit denen von Mikroben verbunden, wobei der Grad zwischen 2 und 9 lag. Die Nitrifikations- und Ammonifikationseffizienzknoten hatten den höchsten Grad und waren beispielsweise positiv mit Nocardioides, Rhodobacter, und Sphingomonas. Die Effizienz der Entfernung organischer Verbindungen war positiv mit Blastocatella, Ornithinibacter und Terrimonas verbunden, wohingegen sie im Biofilmnetzwerk keine Kanten aufwies.

Die Artenvielfalt beider Biomasseformen wurde anhand der Indizes Chao1 und Shannon untersucht. In allen Proben waren die Werte beider Indizes im Biofilm signifikant höher. Dieser Befund steht im Einklang mit den Ergebnissen von Dong et al.14 mit einem ähnlichen Reaktor; Jo et al.12 erzielten jedoch gegenteilige Ergebnisse und beobachteten keine ähnlichen Unterschiede. Sie spekulierten, dass dieser Mangel an Unterschieden auf die Tatsache zurückzuführen sein könnte, dass sowohl Herden als auch Biofilm aus mikrobieller Aggregation resultieren. Andererseits haben Biofilme eine schichtartige Struktur und die Bedingungen in jeder Schicht sind etwas unterschiedlich, was für die Entwicklung verschiedener Bakteriengruppen optimal ist. Dies könnte der Grund dafür sein, dass in der vorliegenden Studie die Biofilmgemeinschaft reicher und vielfältiger war als die des Belebtschlamms.

Während des Experiments wurden verschiedene Belüftungsstrategien angewendet, die das Wachstum der Mikroorganismen im Reaktor beeinflussten. Offenbar hatte die Änderung der Belüftungsstrategie einen stärkeren Einfluss auf die Bakteriengemeinschaft des Belebtschlamms als auf die Biofilmgemeinschaft. Bei der PCoA-Analyse waren die Biofilmproben mit Ausnahme der ersten Probe dichter geclustert als die Belebtschlammproben. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die Biofilm-Gemeinschaft resistenter gegenüber veränderten Umweltbedingungen ist als die Belebtschlamm-Gemeinschaft. Diese Resistenz gegenüber Veränderungen kann durch die Tatsache erklärt werden, dass Biofilm eine komplexe Bakterienstruktur ist und von einer Schicht aus extrazellulären Polymersubstanzen (EPS) umgeben ist, die von den Mikroben produziert werden und als physikalische Barriere wirken, die die Bakterienzellen vor Umweltstress schützt.

In beiden Arten von Biomasse waren Proteobakterien und Bacteroidota die am häufigsten vorkommenden Phyla. Proteobakterien sind typischerweise die am häufigsten vorkommende Gruppe in Bakteriengemeinschaften in kommunalen Abwasseraufbereitungssystemen. Dieses Taxon hat viele Untergruppen, die häufigste davon sind Betaproteobakterien, die maßgeblich für die Entfernung organischer Stoffe und Nährstoffe verantwortlich sind15. Die zweithäufigsten Phyla im Biofilm waren Chloroflexi, Actinobacteriota und Acidobacteriota. Chloroflexi sind filamentöse Bakterien, die die Bildung mikrobiologischer Strukturen begünstigen. Ihre Filamente ragen aus Flocken und Biofilmen heraus, was ihnen wahrscheinlich einen besseren Zugang zu Substraten in der umgebenden Flüssigkeit verschafft9 und vermutlich Gerüste bildet, auf denen sich Belebtschlammflocken bilden16,17. Es wurde berichtet, dass Actinobacteriota sowie Proteobacteria und Bacteroidota zu den Kernstämmen gehören, die in Abwasseraufbereitungssystemen weit verbreitet sind18,19. Acidobacteriota sind an der P-Entfernung beteiligt und haben das Potenzial, verschiedene organische Verbindungen zu nutzen, darunter Glucose, Xylose, Acetat und Fettsäuren20. Nach Proteobacteria und Bacteroidota waren Actinobacteriota und Patescibacteria (insbesondere die nicht kultivierten Saccharimonadales) die zweithäufigsten Phyla im Belebtschlamm. Patescibakterien haben eine kleine Zellgröße und ein reduziertes Genom, was darauf hindeutet, dass es sich um wirtsabhängige Syntrophe oder Parasiten handelt21. Ihre geringe Zellgröße könnte in oligotrophen Umgebungen aufgrund ihres entsprechend erhöhten Oberflächen-Volumen-Verhältnisses von Vorteil sein22. Die Gattung Zooglea kam im Belebtschlamm häufiger vor als im Biofilm. Zooglea produzieren Exopolysaccharide, die an der Bildung von Belebtschlammflocken23 beteiligt sind.

Die Netzwerkanalyse ergab, dass positive Zusammenhänge zwischen der Häufigkeit von Taxa und der Effizienz der Entfernung von Stickstoff- und Phosphorverbindungen in der Biofilm-Gemeinschaft häufiger auftraten als in der Belebtschlamm-Gemeinschaft. Dies könnte darauf hindeuten, dass Biofilm eine bessere Umgebung für das Wachstum von Bakterien darstellt, die diese Verbindungen zersetzen können. Diese Hypothese wird auch durch die hohe Häufigkeit bestimmter Bakteriengruppen im Biofilm gestützt. Beispielsweise kamen sowohl der Stamm Nitrospirota als auch die Gattung Nitrospira im Biofilm deutlich häufiger vor als im Belebtschlamm. Nitrospirota umfasst Bakterien, die Nitrite zu Nitraten (NOB) oxidieren, sowie die kürzlich entdeckten Comammox-Bakterien (vollständige Ammoniakoxidationsmittel), die beide Schritte des Nitrifikationsprozesses durchführen können24,25. Dies könnte darauf hindeuten, dass der Commamox-Prozess im Biofilm für die Ammoniakoxidation wichtig sein könnte. Nitrosomonas, ein Vertreter der Ammoniak oxidierenden Bakterien (AOB), kam ebenfalls häufiger im Biofilm vor, war jedoch nicht so zahlreich wie Nitrospira. Die Ergebnisse dieser Studie ähneln denen von Shao et al.26, die anhaftenden Biofilm und Belebtschlammflocken in einem integrierten Festfilm-Aktivschlamm-Sequenzierungs-Batch-Biofilmreaktor (IFAS-SBR) verglichen. Nitrosomonas hatte auch eine negative Assoziation mit dem Anammox-Bakterium Candidatus Brocadia, was möglicherweise auf die Konkurrenz um dasselbe Substrat zurückzuführen ist. Wahrscheinlich kam Candidatus Brocadia in tieferen Schichten eines Biofilms häufig vor, wo die Sauerstoffkonzentration niedrig ist. Hosokawa et al.27 berichteten, dass Anammox-Bakterien zusammen mit Patescibakterien vorkommen, in unserer Studie waren diese Taxa jedoch im Belebtschlamm häufiger anzutreffen. Vielleicht ist dies ein Beispiel für die Zusammenarbeit von Biofilm mit Belebtschlamm in einem Hybridsystem. Denitrifikatoren waren im Biofilm sehr häufig anzutreffen, obwohl sie auch im Belebtschlamm recht häufig vorkamen. Von dieser Gruppe von Mikroorganismen waren Denitratisoma, Rhodobacter und Dechlorosoma im Biofilm vorhanden, während Rhodobacter und Thaurea im Belebtschlamm vorkamen.

Bai et al.28 beobachteten ähnliche Ergebnisse und kamen zu dem Schluss, dass Biofilm eine bessere Umgebung für die Entwicklung von Denitratisoma, Rhodobacter und Dechlorosoma darstellt als Belebtschlamm, da der Biofilm eine längere feste Verweildauer aufweist. Interessanterweise beobachteten diese Autoren auch, dass sich im Belebtschlamm mehr Phosphor akkumulierende Organismen (PAO) befanden. Dies unterscheidet sich von den Ergebnissen der vorliegenden Studie, in der beispielsweise C. Accumulibacter, ein PAO, häufiger im Biofilm vorkam als in den Belebtschlammflocken. McIlroy et al.29 berichteten, dass Candidatus Competibacter auch in Biofilmproben recht zahlreich vorkam; Hierbei handelt es sich um einen Glykogen-akkumulierenden Organismus, von dem angenommen wird, dass er mit PAOs um Ressourcen konkurriert. Obwohl Zusammenhänge zwischen Bakterien und der Effizienz der verschiedenen Schadstoffentfernungen beobachtet wurden, gibt es keinen klaren Zusammenhang zwischen Bakterien und der Konzentration von Stickstoffformen. Da beispielsweise Nitrosomonas Ammoniak oxidieren, ist zu erwarten, dass im Netzwerk die Häufigkeit von Nitrosomonas umgekehrt proportional zur Ammoniakkonzentration und direkt proportional zur Nitratkonzentration ist. Solche offensichtlichen Abhängigkeiten traten im analysierten Netzwerk jedoch nicht auf. Der Grund dafür kann darin liegen, dass im getesteten System unterschiedliche Prozesse ablaufen, die von vielen verschiedenen Gruppen von Mikroorganismen ausgeführt werden und sich auf die Konzentration einzelner Stickstoffformen auswirken. Da viele verschiedene Bakteriengruppen bei der Entfernung von Stickstoffverbindungen aus dem Abwasser zusammenarbeiten und so eine Art funktionelles Ganzes bilden, ist es schwierig, den Beitrag einzelner Einheiten in diesem Prozess zu bestimmen.

Obwohl die Anzahl der Knoten in den Biofilm- und Belebtschlammnetzwerken ähnlich war, war die Anzahl der Interaktionen zwischen Knoten im Biofilmnetzwerk größer. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die im Biofilm vorhandenen Gattungen stärker miteinander interagieren als diejenigen im Belebtschlamm. Die Korrelationen in der Taxa-Häufigkeit waren bei beiden Arten von Biomasse überwiegend positiv. Auch Jo et al.12 stellten in ihrer Forschung eine größere Anzahl positiver als negativer Korrelationen fest, allerdings war die Anzahl positiver Assoziationen in ihrer Studie (92 % im Biofilm-Netzwerk und 75 % im Belebtschlamm-Netzwerk) viel höher bei uns (55 %). Basierend auf ihrer Betweenness-Zentralität wurden Schlüsseltaxa in beiden Netzwerken identifiziert. Mikroorganismen mit hoher Betweenness-Zentralität liegen oft auf dem kürzesten Weg zwischen zwei anderen Knoten und werden aus diesem Grund als wichtig für den Informationsfluss zwischen Community-Mitgliedern angesehen30. Eines dieser Schlüsseltaxa im Biofilmnetzwerk war Paracoccus, ein heterotrophes nitrifizierendes und aerobes denitrifizierendes Bakterium, das auch Phosphor entfernen kann31. Weitere Bakteriengruppen mit hoher Betweenness-Zentralität waren Pseudoxanthomonas (in der Lage, Stickstoff und Phosphor unter aeroben Bedingungen zu entfernen32) und Phaeodactylibacter (ein Denitrifizierer33). Im Belebtschlammnetzwerk hatten Dongia und Diaphorobacter die höchste Betweenness-Zentralität; diese Taxa sind an der Stickstoffumwandlung beteiligt Verbindungen27,34. Die Unterschiede zwischen dem Biofilm und dem Belebtschlammnetzwerk deuten auch darauf hin, dass möglicherweise andere Bakterien für die Umwandlung von Stickstoffverbindungen in diesen beiden Umgebungen verantwortlich sind. Netzwerkanalysen und die hohen Werte der Betweenness-Zentralität der oben genannten Taxa legen nahe, dass sogar Taxa mit geringer Häufigkeit könnten eine wichtige Rolle in der Bakteriengemeinschaft spielen. Die Rolle solcher Bakterien in Abwasserbehandlungsprozessen ist nicht genau bekannt und bedarf weiterer Untersuchungen.

Diese Studie verglich die Strukturen der mikrobiellen Gemeinschaften in Biofilm und Belebtschlamm aus einem IFAS-MBSBBR-Hybridreaktor. Die bakterielle Zusammensetzung des Biofilms unterschied sich von der des Belebtschlamms, obwohl einige Kerngruppen von Bakterien (Proteobacteria, Bacteroidota, Actinobacteriota und Acidobacteriota) in beiden Arten von Biomasse sehr häufig vorkamen. Der Biofilm war hinsichtlich der Bakterienzusammensetzung vielfältiger und bot eine bessere Umgebung für die Entwicklung von Nitrifikanten (z. B. Nitrospira, Nitrosomonas) und Phosphor akkumulierenden Organismen (C. Accumulibacter). Die Bakterien im Biofilm-Netzwerk hatten mehr Verbindungen untereinander als die im Belebtschlamm-Netzwerk. Darüber hinaus waren im Biofilmnetzwerk mehr Bakterien mit der Effizienz der Stickstoff- und Phosphorentfernung verbunden, was darauf hindeutet, dass Biofilm möglicherweise eine größere Rolle bei der Entfernung dieser Schadstoffe spielt. Die Netzwerkanalyse ergab auch, dass selbst Bakterien mit geringer Häufigkeit eine wichtige Rolle in der Gemeinschaft spielen könnten, obwohl diese Rollen weiterer Untersuchungen bedürfen. Ein besseres Verständnis des Beitrags dieser Taxa wird ein vollständigeres Bild dieser komplexen Gemeinschaften und der Beziehungen zwischen den Bakterien, die sie erzeugen, liefern.

Die Studie wurde in einem Labormodell eines Sequenzierungs-Batch-Reaktors mit einem aktiven Volumen von 28 l durchgeführt, in dem sich Mikroorganismen in Form von Belebtschlamm und Biofilm auf dem EvU-Perl-Wanderbett (Integrated Fixed-Film Activated Sludge – Moving-Bed) entwickelten Sequenzierungs-Batch-Biofilmreaktor – IFAS-MBSBBR). Die zylindrischen Träger mit den Abmessungen Φ5 mm, h = 8 mm und einer spezifischen Oberfläche von 600 m2/m3 machten 25 % des aktiven Volumens des Reaktors aus. Die Belebtschlammkonzentration wurde auf einem Niveau von etwa 1,7 g MLSS/L gehalten. Der Betrieb von IFAS-MBSBBR wurde vollständig automatisiert und durch die DreamSpark Premium-Software (SCADA-System) gesteuert. Das Abwasser wurde dem Reaktor mittels einer peristaltischen Pumpe Ismatec Ecoline zugeführt und sein Inhalt mit einem langsam laufenden Paddelmischer CAT R-50D gerührt. Die Sauerstoffkonzentration wurde mit einer optischen Sonde Oxymax COS61D gemessen, die mit einem Sender Liguiline CM 442 zusammenarbeitete. Das System wurde in einem klimatisierten Raum betrieben, der eine Temperatur von 20 °C im Reaktor gewährleistete.

Der Reaktor wurde mit synthetischem Abwasser versorgt, das die Zusammensetzung kommunaler Abwässer simulierte. Folgende Abwassereigenschaften wurden angenommen: CSB 510 mg O2/L, TN 60 mg N/L, N-NH4+ 40 mg N-NH4+/L, P-PO43− 8 mg P-PO43−/L, pH 7,7. Ihre Zubereitung verwendete Pepton (135 mg/L), Stärke (45 mg/L), Glucose (45 mg/L), Glycerin (0,0495 ml/L), Ammoniumacetat (225 mg/L), NaHCO3 (125 mg/L). ), Na2HPO4 (15 mg/L) und KH2PO4 (4,5 mg/L).

Der Reaktor arbeitete in einem System von drei Acht-Stunden-Zyklen pro Tag. Ein einzelner Behandlungszyklus umfasste die folgenden Phasen: I. Phase ohne Belüftung mit Abwasserdosierung (50 Min.), I. Phase mit Belüftung (190 Min.), II. Phase ohne Belüftung mit Abwasserdosierung (30 Min.), II. aerobe Phase (150 Min.), Sedimentation (50 Min.), Dekantierung (10 Min.). Während der 573 Tage der Versuchsdauer wurden in aeroben Phasen Perioden mit ausgeschalteter Gebläseeinheit eingeführt, um eine intermittierende Belüftungsstrategie zu erhalten, oder es wurde die Sauerstoffkonzentration geändert. Darüber hinaus wurde zwischen dem 447. und 547. Forschungstag die Kontaminationsbelastung des Reaktors durch eine Verringerung der Abwasserdosis von 10 L/Tag auf 6,6 L/Tag verringert (Tabelle 2). Zwischen Dezember 2018 und Juni 2020 wurden Zu- und Abflussproben entnommen. Die chemische Analyse erfolgte nach Standardmethoden (Tabelle_S2).

Von Dezember 2018 bis Juni 2020 wurden in festgelegten Abständen Biomasseproben für mikrobiologische Tests aus Biofilm und Belebtschlamm entnommen. Die Proben wurden bei -25 °C gelagert. DNA wurde aus 200 ng Biomasse (sowohl Belebtschlamm als auch Biofilm) mithilfe einer FastDNA isoliert ™ SPIN Kit für Boden (MP Biomedicals, USA). Das Isolierungsverfahren wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Zur Messung der Menge an isolierter DNA wurde ein Qubit-Fluorometer (Invitrogen, USA) verwendet. Die erhaltene DNA wurde bis zur weiteren Analyse bei –18 °C gelagert.

Eine Hochdurchsatz-Illumina-Sequenzierung, die auf die V3-V4-Region des 16S-rRNA-Gens abzielte, wurde mit den Primern Sd-Bact-0341-bS-17 und Sd-Bact-0785-aA-2135 und NEBNext®High-Fidelity 2X PCR Master Mix durchgeführt ( Bio Labs Inc., USA) gemäß der Anleitung des Herstellers. Die Sequenzierungsreaktionen wurden mit einem MiSeq-Sequenzer und einem MiSeq Reagent Kit V2 (Illumina, USA) unter Anwendung der Paired-End-Technologie mit Leselängen von 2 × 250 bp gemäß den Protokollen des Herstellers durchgeführt.

Rohe Paired-End-Sequenzen wurden mit dem Softwarepaket QIIMEII36 verarbeitet. Paired-End-Sequenzen wurden mithilfe des Fast-Join-Algorithmus zusammengeführt. Lesevorgänge, die von der Software nicht zusammengeführt werden konnten, wurden von weiteren Analysen ausgeschlossen. Der Qualitätsfaktor des Filterprozesses (q < 20) wurde mit dem Cutadapt-Algorithmus37 ermittelt. Chimäre Sequenzen wurden mithilfe von USEARCH38.16S erkannt und von Analysen ausgeschlossen. rRNA-OTUs wurden aus den Illumina-Lesevorgängen mithilfe eines OTU-Auswahlprotokolls mit geschlossener Referenz gegen die Datenbank SILVA_V_138 ausgewählt39. Die Sequenzen wurden mit einer Identität von 97 % geclustert und so zugeschnitten, dass sie nur die von den Sequenzierungsprimern flankierte 16S-rRNA-V4-Region umfassten. Taxonomiezuweisungen wurden OTUs zugeordnet, basierend auf der Taxonomie, die mit der SILVA_V_138-Referenzsequenz verknüpft war, die jede OTU definierte.

Der statistische Vergleich von Biofilm- und Belebtschlammproben wurde mit der STAMP-Software (Statistical Analysis of Metagenomics Profiles (http://kiwi.cs.dal.ca/Software/STAMP)) 40 durchgeführt. Die Signifikanz wurde mit dem nichtparametrischen t-Test von White bestimmt . Ergebnisse mit P < 0,05 wurden als signifikant angesehen.

Basierend auf einer Korrelationsanalyse der taxonomischen Profile wurden Netzwerke für das gemeinsame Vorkommen von Bakterien erstellt41. Für die Analyse wurden die am häufigsten vorkommenden Taxa in den untersuchten Metagenomen ausgewählt. Die Korrelationsanalyse nach Spearman (mit einem Signifikanzschwellenwert von α = 0,05) wurde mit STATISTICA v.13.1 (StatSoft, Inc, Tulsa, OK, USA) durchgeführt. Netzwerke wurden nur für stark korrelierte Taxa (mit Korrelationskoeffizienten über 0,75 oder unter -0,75) aufgezeichnet. Die so gewonnenen Korrelationsmatrizen wurden zur Erstellung von Netzwerken mithilfe der Gephi-Software42 verwendet. Alpha- und Beta-Diversitätsanalysen wurden mithilfe der EZBioCloud-Plattform43 durchgeführt.

Die gelesenen Sequenzen wurden im NCBI Sequence Read Archive (SRA) unter der Zugangsnummer PRJNA793374 hinterlegt.

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Diese Arbeit wurde vom Polnischen Nationalen Wissenschaftszentrum Nr. UMO-2017/27/B/NZ9/01039 finanziert.

Abteilung für Umweltbiotechnologie, Universität Ermland und Masuren in Olsztyn, Sloneczna 45G, 10-709, Olsztyn, Polen

Martyna Godzieba & Slawomir Ciesielski

Abteilung für Wasserversorgung und Abwasserbehandlung, Fakultät für Gebäudetechnik, Wasser- und Umwelttechnik, Technische Universität Warschau, Nowowiejska 20, 00-653, Warschau, Polen

Monika Zubrowska-Sudol & Justyna Walczak

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MG: Konzeptualisierung, Untersuchung, formale Analyse, Visualisierung, Schreiben – Originalentwurf. MZ-S.: Konzeptualisierung, Methodik, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, JW: Untersuchung, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung. SC: Konzeptualisierung, Methodik, Supervision, Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung.

Korrespondentin ist Martyna Godzieba.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Godzieba, M., Zubrowska-Sudol, M., Walczak, J. et al. Entwicklung mikrobieller Gemeinschaften in Biofilm und Belebtschlamm in einem Hybridreaktor. Sci Rep 12, 12558 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16570-z

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Eingegangen: 25. April 2022

Angenommen: 12. Juli 2022

Veröffentlicht: 22. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16570-z

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Internationale Zeitschrift für Umweltwissenschaften und -technologie (2022)

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