Bau einer Untereinheit

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 19183 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Metallochaperone sind metallbindende Proteine, die dazu dienen, das entsprechende Metall an ein Zielprotein zu liefern. Das Metall wird normalerweise zwischen verschiedenen Proteinen übertragen. In dieser Studie haben wir entdeckt, dass Metall zwischen derselben Untereinheit einer mutierten Nitrilhydratase (NHase) übertragen wurde. Verschiedene „Aktivatorproteine“ vermitteln den Transport von Metallionen in NHasen. Wir konstruierten Fusions-NHasen durch Fusion der β- und α-Untereinheiten und/oder der „Aktivatorproteine“ der NHase aus Pseudomonas putida. Die Fusions-NHasen zeigten eine höhere Thermostabilität und Toleranz gegenüber hohen Konzentrationen des Produktamids. Der Mechanismus des Kobalt-Einbaus änderte sich von einem Selbst-Untereinheits-Austauschmuster zu einem Apoprotein-spezifischen molekularen Chaperon-Muster in vivo und einem Metallochaperon-Muster in vitro. Bemerkenswerterweise fand der Kobalttransfer zwischen derselben α-Untereinheit im Metallochaperonmuster statt. Diese Ergebnisse zeigten nicht nur die Überlegenheit von NHasen vom Fusionstyp, sondern zeigten auch ein innovatives Metallionentransfermuster in der Metalloprotein-Biosynthese.

Metalloproteine ​​werden seit Jahrzehnten intensiv charakterisiert und mehr als ein Drittel aller Proteine ​​sind Metalloproteine1. Zu den durch Metallionen in Proteinen vermittelten Rollen gehören Elektronentransfer, Sauerstofftransport, Genregulation und Strukturstabilisierung2. In einem Aufsatz3 wurden mehrere allgemeine Mechanismen der Metallozentrumsbiosynthese beschrieben; Eine davon ist die Metallochaperonabgabe eines Metallions oder metallhaltiger Moleküle. Metallochaperone sind metallbindende Proteine, die dazu dienen, die entsprechenden Metallionen oder metallhaltigen Moleküle an ein Zielprotein zu liefern. Das Zielprotein und das Metallochaperon sind normalerweise unterschiedliche Proteine ​​und das Zielprotein weist Ligandenspezifität und eine höhere Affinität für das Metallion auf.

Nitrilhydratase (NHase, EC 4.2.1.84)4 ist ein Enzym, das die Hydratisierung einer breiten Palette von Nitrilen zu den entsprechenden Amiden5 katalysiert. Das Enzym besteht aus α- und β-Untereinheiten und enthält entweder ein Nicht-Häm-Eisen (Fe-NHase)6 oder ein Nicht-Corrin-Kobalt (Co-NHase)7,8. Der Transport von Metallionen in NHasen wird durch die entsprechenden „Aktivatorproteine“9 vermittelt. Es wurde gezeigt, dass die Aktivatoren für Fe-NHasen als Metallochaperone wirken10, während die „Aktivatorproteine“ als „Chaperone zum Austausch von Selbstuntereinheiten“ für den Cobalt-Einbau in die meisten Co-NHasen fungieren9,11,12.

Der Austausch von Selbstuntereinheiten ist einer der posttranslationalen Reifungsschritte der Co-NHase-Familie11. Das Aktivatorprotein liegt als Komplex mit der α-Untereinheit von NHase vor und der Einbau von Kobalt in NHase hängt vom Austausch der α-Untereinheit zwischen der kobaltfreien α-Untereinheit von NHase und der kobalthaltigen α-Untereinheit des Komplexes ab9. Der Austausch von Selbstuntereinheiten unterscheidet sich deutlich von den derzeit bekannten allgemeinen Mechanismen der Metallozentrumsbiosynthese9,11,13, die in einem Aufsatz von Kuchar und Hausinger3 beschrieben wurden, und zwar wie folgt: (i) reversible Metallionenbindung; (ii) Metallochaperon-Abgabe eines Metallions oder Cofaktors; (iii) posttranslationale Modifikation, die eine Metallbindungsstelle erzeugt; (iv) synergistische Bindung eines Metalls mit einer anderen Komponente; (v) Synthese metallhaltiger Cofaktoren; (vi) Metalleinbau gekoppelt mit Elektronentransfer; und (vii) Bedarf an einem Apoprotein-spezifischen molekularen Chaperon usw.14. Der Austausch von Selbstuntereinheiten wurde zuerst in der L-NHase von Rhodococcus rhodochrous J19 und später in der H-NHase desselben Stamms entdeckt11 und es wird spekuliert, dass er in verschiedenen anderen Co-NHasen und einem Enzym der NHase-Familie, der Thiocyanathydrolase, auftritt enthält außerdem ein einzigartiges Nicht-Corrin-Kobaltzentrum mit zwei posttranslational modifizierten Cysteinliganden12,15. „Self-Subunit-Swapping-Chaperone“ weisen im Gegensatz zu Metallochaperonen bei der Metallozentrumsbiosynthese und molekularen Chaperonen bei der Proteinfaltung eine überraschende Proteinfunktion auf9,11.

NHase wird häufig in der industriellen Produktion von hochreinem Acrylamid und Nikotinamid4 eingesetzt. Allerdings sind die meisten NHasen mit hoher Aktivität während der industriellen Anwendung instabil16. Beispielsweise sind die NHasen von Pseudomonas chlororaphils B23 und Rhodococcus sp. N-774 ist unter 20 °C stabil17,18 und die NHase von Rhodococcus rhodochrous J1 ist lediglich zwischen 10 und 30 °C stabil19. Da es sich bei der Nitrilhydratisierung um eine exotherme Reaktion handelt, muss die Reaktionstemperatur niedrig gehalten werden, um die NHasen durch Kühlung zu stabilisieren, was normalerweise enorme unnötige Energiekosten verursacht16. Darüber hinaus ist in der industriellen Fertigung eine Toleranz gegenüber hohen Konzentrationen des Produktamids erforderlich. Daher ist für die industrielle Fertigung eine stabilere NHase mit hoher Aktivität und hoher Toleranz erforderlich.

Die Genfusion von Untereinheiten kann die Proteinstabilität verbessern20,21,22. Bei der Genfusion handelt es sich um eine Strategie, mit der zwei oder mehr zuvor unterschiedliche Gene zu einem einzigen offenen Leserahmen verschmolzen werden. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Fusionsereignisse dazu neigen, den Zusammenbau zu optimieren, indem sie die Topologien von Proteinkomplexen vereinfachen23. Kürzlich wurde eine neue Genstruktur von NHase im Eukaryoten Monosiga brevicollis vorhergesagt24. Die beiden normalerweise getrennten NHase-Untereinheiten (β- und α-Untereinheiten) sind in dieser NHase in einem Peptid fusioniert. Man geht davon aus, dass die Fusions-NHase vorteilhafte Eigenschaften wie höhere Aktivität, höhere Stabilität oder neue Substratspezifitäten aufweist24. Daher könnte die Genfusionsstrategie ein wirksames Instrument zur Verbesserung der Anwendung der NHase sein.

In dieser Studie konstruierten wir einen neuen Typ von NHase mit nur einem Polypeptid, indem wir die β- und α-Untereinheiten der NHase aus Pseudomonas putida NRRL-18668 (P. putida) fusionierten. Die Fusions-NHase zeigte eine deutlich höhere Thermostabilität und Produkttoleranz als der Wildtyp. Für die Fusions-NHase-Aktivierung war auch das Aktivatorprotein P14K notwendig. Darüber hinaus wurde P14K weiter mit der Fusions-NHase der β- und α-Untereinheiten fusioniert, was zur Bildung einer weiteren Fusions-NHase führte. Aufgrund dieser Strukturveränderungen wurde der Kobalt-Einbaumechanismus der NHase verändert. Der Komplex α(P14K)2 (zwei P14Ks wurden mit der α-Untereinheit kombiniert) spielte als Metallochaperon eine Rolle bei der Übertragung eines Kobaltions in die Fusions-NHasen in vitro. Der Kobalttransfer erfolgte in derselben α-Untereinheit zwischen kobaltfreier NHase (Apo-NHase) und dem Komplex α(P14K)2, was ein innovatives Metallionentransfermuster in der Metalloproteinbiosynthese offenbarte. Darüber hinaus fungiert P14K höchstwahrscheinlich als Apoprotein-spezifisches molekulares Chaperon für den Kobalt-Einbau in vivo.

Die NHase aus P. putida wurde zuvor in Escherichia coli BL2125 erfolgreich konstruiert und überexprimiert. Basierend auf der Genstruktur von Monosiga brevicollis konstruierten wir zwei mutierte NHasen mit Genfusion von Untereinheiten. Die zuvor unterschiedlichen Gene der β- und α-Untereinheiten (B- und A-Gene) wurden mit einem Linker (Dipeptid, Prolin-Glycin) zu einem Gen (BA) fusioniert; Das fusionierte Gen (BA) wurde in das Plasmid pET28a eingefügt, was zu pET28a-(BA) führte (Abb. 1a). Als nächstes wurde das Aktivatorgen P14K stromabwärts des mutierten Gens (BA) eingefügt, was zu pET28a-(BA)P14K führte. Die Transformanten, die pET28a-(BA) und pET28a-(BA)P14K enthielten, wurden zur Expression von NHase verwendet. Als Ergebnis wurde NHase-Aktivität nachgewiesen und jede der entsprechenden Proteinbanden der Transfomanten war auf der SDS-PAGE offensichtlich, was darauf hinweist, dass die beiden Fusions-NHasen erfolgreich exprimiert wurden (Abb. 1b). Im Folgenden werden die von den Genen (BA) und (BA)P14K kodierten Fusions-NHasen als NHase-(BA) bzw. NHase-(BA)P14K bezeichnet.

Konstruktion, Expression und Reinigung der rekombinanten NHases.

(a) Genetische Organisation für die Konstruktion einer Reihe von Plasmiden. (b) SDS-PAGE eines zellfreien Extrakts jedes Transformanten. 1, Markierung; 2, Wildtyp-NHase; 3, NHase-(BA); 4, NHase-(BA)P14K; 5, NHase-(BAP14K). (c) SDS-PAGE der gereinigten Enzyme. 1, Markierung; 2, Wildtyp-NHase; 3, NHase-(BA); 4, NHase-(BA)P14K; 5, NHase-(BAP14K).

NHase-(BA) und NHase-(BA)P14K wurden gereinigt und charakterisiert (Abb. 1c) und mit der Wildtyp-NHase verglichen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, waren die spezifische Aktivität und kcat von NHase-(BA)P14K höher als die von Wildtyp-NHase, was zeigt, dass die Fusion der β- und α-Untereinheiten die Aktivität erhöhte. Der Kobaltgehalt von NHase-(BA) betrug ungefähr 14 % des NHase-(BA)P14K, was darauf hinweist, dass P14K auch für den Kobaltinbau notwendig war, sogar in der Fusions-NHase (Tabelle 1). Die Michaelis-Konstante (Km-Wert) von NHase-(BA) und NHase-(BA)P14K war höher (ungefähr 1,5-fach) als die der Wildtyp-NHase, was darauf hindeutet, dass die β- und α-Untereinheiten fusionierten könnte den Prozess der Substratbindung an das aktive Zentrum einschränken. Die MALDI-TOF-Massenanalyse des NHase-(BA)P14K ergab, dass das NHase-(BA)P14K die volle Länge von βα aufweist (Abb. S1). Die Wildtyp-NHase ist ein Tetramer (α2β2); Die Molekularmasse der Fusionsenzyme wurde durch Gelfiltrationschromatographie bestimmt. Die Molekularmassen von NHase-(BA) und NHase-(BA)P14K betrugen 97,8 kDa bzw. 85,1 kDa (Abb. 2). Da die berechnete Molekülmasse von fusioniertem βα 49,2 kDa beträgt, sollten beide Fusions-NHasen Dimere sein [(βα)2]. Mithilfe der Fern-UV-Zirkulardichroismus (CD)-Spektrenanalyse führten wir einen detaillierten Vergleich jeder Eigenschaft zwischen Wildtyp-NHase, NHase-(BA) und NHase-(BA)P14K durch. Die Spektren von NHase-(BA) und NHase-(BA)P14K unterschieden sich von denen der Wildtyp-NHase (Abb. 3a), was darauf hindeutet, dass die Sekundärstruktur von NHase-(BA) oder NHase-(BA)P14K ist nicht dasselbe wie das der Wildtyp-NHase.

Bestimmung der Molekülmasse und Strukturen der Fusions-NHasen.

Für die Gelfiltration verwendete Markerproteine: (i) Glutamatdehydrogenase (Hefe) (290 kDa); (ii) Laktatdehydrogenase (Schweineherz) (142 kDa); (iii) Enolase (Hefe) (67 kDa); (iv) Myokinase (Hefe) (32 kDa); und (v) Cytochrom c (Pferdeherz) (12,4 kDa).

Fern-UV-CD- (a) und UV-Vis-Absorptionsspektren (b–d) der Wildtyp-NHase und der Fusions-NHase.

P14K war für den Einbau von Kobalt in die Wildtyp-NHase und die Fusions-NHase erforderlich. Wir haben versucht, ein Fusionsproteingen mit drei Untereinheiten (BAP14K) zu konstruieren, das P14K weiter an den (βα)-Carboxylterminus von NHase-(BA) fusionierte. Das fusionierte Gen (BAP14K) wurde in das Plasmid pET28a eingefügt, was zu pET28a-(BAP14K) führte (Abb. 1a). Der Transformant, der pET28a-(BAP14K) beherbergt, wurde für die NHase-Expression verwendet. Als Ergebnis wurde die entsprechende Proteinbande der mutierten NHase auf der SDS-PAGE nachgewiesen (Abb. 1b), was darauf hinweist, dass die Fusions-NHase erfolgreich exprimiert wurde. Im Folgenden wird die vom Gen (BAP14K) kodierte Fusions-NHase als NHase-(BAP14K) bezeichnet. Das NHase-(BAP14K) wurde gereinigt und charakterisiert (Abb. 1c). Wie in Tabelle 1 gezeigt, waren die spezifische Aktivität und kcat von NHase-(BAP14K) höher als die von Wildtyp-NHase und die Unterschiede in der spezifischen Aktivität und kcat zwischen NHase-(BAP14K) und NHase-(BA)P14K waren gering . Im Vergleich zu Wildtyp-NHase und NHase-(BA)P14K war der Km-Wert von NHase-(BAP14K) am höchsten, was darauf hindeutet, dass die Fusion von P14K die Substratbindung weiter einschränkte. Die Molekülmasse des NHase-(BAP14K) wurde durch Gelfiltrationschromatographie bestimmt. Die Molekülmasse der NHase-(BAP14K) betrug 150,6 kDa. Da die berechnete Molekülmasse des Fusions-βαP14K 67,0 kDa beträgt, sollte das NHase-(BAP14K) Dimer [(βαP14K)2] sein (Abb. 2). Das CD-Spektrum von NHase-(BAP14K) ähnelte dem von NHase-(BA)P14K (Abb. 3a), was darauf hinweist, dass die Sekundärstruktur von NHase-(BAP14K) der von NHase-(BA) ähnelt )P14K, unterscheidet sich jedoch vom Wildtyp.

Da die NHase-(BAP14K) eine höhere NHase-Aktivität als der Wildtyp aufwies, untersuchten wir die Auswirkung der P14K-Position auf die Fusions-NHase-Aktivität. Wir haben zwei weitere Fusions-NHase-Gene mit drei Untereinheiten entworfen, (BP14KA) und (P14KBA). In (BP14KA) befand sich das P14K-Gen zwischen den Genen der β- und α-Untereinheiten; In (P14KBA) lag das P14K-Gen vor dem Gen der (βα)-Untereinheit (Abb. 1a). Die Transformanten, die pET28a-(BP14KA) und pET28a-(P14KBA) enthielten, wurden verwendet, um NHase-(BP14KA) bzw. NHase-(P14KBA) zu exprimieren. Die Fusions-NHasen wurden gereinigt und getestet. Die Aktivität von NHase-(BP14KA) betrug 148,6 U/mg, etwa 32 % der Aktivität von NHase-(BAP14K) (452,5 U/mg); Die Aktivität von NHase-(P14KBA) betrug 76,7 U/mg, etwa 17 % der Aktivität von NHase-(BAP14K). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Position von P14K die Fusions-NHases-Aktivität erheblich beeinflusste. Wenn sich P14K stromabwärts des (βα)-Carboxyl-Terminus befindet, zeigte die Fusions-NHase die höchste Aktivität.

Die spezifische Aktivität und kcat von NHase-(BA)P14K und NHase-(BAP14K) waren höher als die der Wildtyp-NHase; Daher haben wir sie hinsichtlich ihrer Thermostabilität und Produkttoleranz weiter verglichen. Die Enzyme wurden bei 50 °C in 10 mM Kaliumphosphatpuffer (KPB) (pH 7,5, enthaltend 0,5 mM Dithiothreitol) inkubiert und die Aktivität jeder NHase wurde alle zehn Minuten gemessen. Wie in Abb. 4a gezeigt, waren die Halbwertszeiten von NHase-(BA)P14K und NHase-(BAP14K) 2,8- bzw. 2-mal länger als die des Wildtyps, was darauf hindeutet, dass NHase-(BA)P14K und NHase -(BAP14K) weisen eine höhere Thermostabilität auf als die Wildtyp-NHase.

Eigenschaftsvergleich der Fusions-NHases mit der Wildtyp-NHase.

(a) Die Analyse der Thermostabilität, (b) Produkttoleranz und (c) pH-Optimum der Fusions-NHases und der Wildtyp-NHase.

Neben der Thermostabilität ist eine hohe Anreicherung des Produkts für die großtechnische Produktion von Vorteil, was zu Energieeinsparungen und einer Vereinfachung des nachgelagerten Prozesses führt19. Um die Toleranz eines hochkonzentrierten Amids des Wildtyps und der Fusionsenzyme zu vergleichen, verwendeten wir Nicotinamid, um die Produkttoleranz der NHasen zu testen. Die Reaktion wurde in 20 mM 3-Cyanopyridin (Substrat) mit und ohne 0,5 M Nicotinamid (Produkt) 10 Minuten lang durchgeführt. Die Reduktion von 3-Cyanopyridin in jeder Reaktion wurde gemessen (Abb. 4b) und das Reduktionsverhältnis (der Anteil der reduzierten 3-Cyanopyridin-Menge in der Reaktion mit und ohne 0,5 M Nicotinamid) berechnet. Die Reduktionsverhältnisse von NHase-(BA)P14K und NHase-(BAP14K) betrugen 0,86 bzw. 0,83 und waren damit höher als die des Wildtyps (0,80), was darauf hindeutet, dass die Fusions-NHasen eine höhere Produkttoleranz aufwiesen als die des Wildtyps Typ.

Die physiologisch optimalen pH-Werte der meisten NHasen variieren zwischen 6,5 und 8,5 und NHase aus P. putida weist ein breites Aktivitätsmaximum zwischen pH 7,2 und 7,826 auf. Der optimale pH-Wert der Fusions-NHasen wurde gemessen und mit dem Wildtyp verglichen. Wie in Abb. 4c gezeigt, betrug der optimale pH-Wert des Wildtyps NHase-(BA)P14K und NHase-(BAP14K) 7,5, 8,0 bzw. 7,5. Obwohl NHase-(BAP14K) einen ähnlichen stabilen Bereich wie der Wildtyp aufwies, war der stabile Bereich von NHase-(BA)P14K breiter und lag zwischen 6,5 und 9,0, was darauf hindeutet, dass diese Fusion den geeigneten pH-Bereich von NHase erweitern könnte .

P14K ist für den Einbau von Kobalt in die NHase von P. putida12 erforderlich. P14K bildet mit der α-Untereinheit der NHase einen Komplex α(P14K)2. Es wurde bestätigt, dass der Einbau von Kobalt in die NHase von der Substitution der α-Untereinheit zwischen dem kobalthaltigen α(P14K)2 und der Apo-NHase abhängt, was zur Bildung der funktionellen NHase12 führt. P14K war auch für den Einbau von Kobalt in die Fusions-NHasen erforderlich (Tabelle 1). Hier untersuchten wir, ob α(P14K)2 die Fusions-NHasen aktivieren kann. Das gereinigte kobalthaltige α(P14K)2 wurde durch Hinzufügen eines Strep-Tags vor P14K erhalten, wie zuvor beschrieben12 (Abb. 1a). Die kobaltfreien Fusions-NHasen [apo-NHase-(BA), apo-NHase-(BA)P14K und apo-NHase-(BAP14K)] wurden in Abwesenheit von Kobalt aus der Kultur gereinigt. Die Apo-Wildtyp-NHase wurde ebenfalls gereinigt und als Kontrolle verwendet. Die gereinigte Apo-Wildtyp-NHase, Apo-NHase-(BA), Apo-NHase-(BA)P14K und Apo-NHase-(BAP14K) wurden jeweils mit dem gereinigten kobalthaltigen α(P14K)2 gemischt und dann inkubiert . Die NHase-Aktivität in allen Mischungen nahm mit zunehmender Inkubationszeit zu und die höchste Aktivität der Fusions-NHasen wurde nach 1 Stunde beobachtet. Jede resultierende NHase [R-Wildtyp-NHase, R-NHase-(BA), R-NHase-(BA)P14K und R-NHase-(BAP14K)] wurde dann aus den Gemischen gereinigt und getestet. Die NHase-Aktivität der R-Wildtyp-NHase ähnelte der der Wildtyp-NHase, was mit den zuvor beschriebenen Prinzipien des Austauschs von Selbstuntereinheiten übereinstimmt12. Interessanterweise betrugen die NHase-Aktivitäten von R-NHase-(BA)P14K und R-NHase-(BAP14K) 240,5 bzw. 219,2 U/mg, was etwa 50 % der entsprechenden kobalthaltigen Fusions-NHasen ausmachte. Die R-NHase-(BA) zeigte auch 30 % Aktivität (147,2 U/mg) der kobalthaltigen Fusions-NHasen (Tabelle 1).

Kobaltion ist für die NHase-Aktivität notwendig. Die Fusions-Apo-NHasen wurden durch α(P14K)2 aktiviert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Kobaltionen von α(P14K)2 auf die Fusions-Apo-NHasen übertragen wurden. Um den Kobalttransfer zwischen α(P14K)2 und den Fusions-Apo-NHasen zu bestätigen, wurden UV-Vis-Absorptionsspektrenanalysen durchgeführt. Wie in Abb. 3 gezeigt, zeigten alle resultierenden Enzyme eine zusätzliche Schulter im Bereich von 300 bis 350 nm (Abb. 3b), ähnlich denen der NHasen (kobalthaltige NHasen) (Abb. 3c), wohingegen die In den Apo-NHasen wurde keine zusätzliche Schulter festgestellt (Abb. 3d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass R-NHase-(BA), R-NHase-(BA)P14K und R-NHase-(BAP14K) kobalthaltige Enzyme waren. Der Kobaltgehalt wurde wie in Tabelle 1 gezeigt bestimmt. R-NHase-(BA), R-NHase-(BA)P14K und R-NHase-(BAP14K) enthielten jeweils 0,23 Mol Ion/Mol (βα), 0,61 Mol Ion /mol (βα) und 0,62 mol Ion/mol (βαP14K). Umgekehrt haben wir auch Apo-NHase, Apo-NHase-(BA), Apo-NHase-(BA)P14K und Apo-NHase-(BAP14K) mit Kobaltionen gemischt und inkubiert. In diesen Mischungen wurde keine signifikante Aktivität festgestellt (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die Fusions-NHasen durch Mischen mit Kobaltionen in vitro nicht aktiviert werden konnten, selbst für Apo-NHase-(BAP14K), das das Fragment von P14K enthielt.

Die Metallionenbindung ist für die posttranslationale Modifikation der beiden Cysteine ​​in der α-Untereinheit in NHase3,26 verantwortlich. Allerdings konnten solche Modifikationen in apo-NHase26 nicht beobachtet werden. Diese Ergebnisse erlaubten uns zu spekulieren, dass die Cysteinreste in der kobalthaltigen Fusions-NHase modifiziert sind, nicht jedoch in der Apo-NHase. Um den Cystein-Oxidationszustand des aktiven Zentrums vor und nach der Cobalt-Insertion zu klären, haben wir Apo-NHase-(BA)P14K, Apo-NHase-(BAP14K), R-NHase-(BA)P14K und R-NHase-(BAP14K) analysiert. durch NanoLC-ESI-MS/MS. Die Enzyme wurden nach Reduktion und Carboxamidomethylierung mit Trypsin behandelt. Die Molekularmasse des Trypsin-hydrolysierten Peptids, das alle Metallligandenreste V351CTLCSCYPWPTLGLPPAWYK371 (VK21) enthält, wurde gemessen. Im Massenspektrum des tryptischen Verdaus von Apo-NHase-(BA)P14K und Apo-NHase-(BAP14K) (Abb. 5a,c, innen) stellten wir fest, dass der Massenpeak mit m/z 1286,15 bzw. 1285,95 übereinstimmte zum m/z-Wert des [M+2H]2+-Ions von VK21 mit drei Carboxamidomethyl-(CAM-)-Cysteinen (der berechnete m/z-Wert betrug 1285,94). Im Massenspektrum des tryptischen Verdaus von R-NHase-(BA)P14K und R-NHase-(BAP14K) (Abb. 5b,d, innen) fanden wir jedoch, dass der massereichste Peak mit m/z 1272,83 und 1272,82 entsprachen jeweils dem m/z-Wert des [M+2H]2+-Ions von VK21, beide mit einem Cys-SO2H und zwei CAM-Cysteinen (der berechnete m/z-Wert betrug 1273,44). Um den/die modifizierten Rest(e) zu identifizieren, führten wir eine MS/MS-Sequenzierung der Ionen mit den m/z 1286,15, 1272,83, 1285,95 und 1272,82 durch. Die Spektren stimmten gut mit dem vorhergesagten Fragmentierungsmuster von VK21 mit Cys355-SO2H in R-NHase-(BA)P14K und R-NHase-(BAP14K) und CAM-Cys355 in Apo-NHase-(BA)P14K und Apo überein. NHase-(BAP14K). Obwohl das Auftreten der Cys-SOH-Modifikation aufgrund ihrer chemischen Instabilität27 nicht bestätigt wurde, deuten diese Ergebnisse stark darauf hin, dass die oxidierten Cysteinreste in den beiden Fusions-NHasen nach der Kobaltinsertion vorhanden sind.

Identifizierung von Cys355-SO2H durch MS/MS-Analyse.

Jedes doppelt geladene Ion entspricht dem VK21-Peptid von (a) Apo-NHase-(BA)P14K, (b) R-NHase-(BA)P14K, (c) Apo-NHase-(BAP14K), (d) R- NHase-(BAP14K) wurde mit einem NanoLC-ESI-MS/MS-System analysiert. Die Massenpeaks mit m/z 1286,15 und 1285,95, die dem [M+2H]2+-Ion des VK21-Peptids mit drei CAM-Cysteinen entsprechen (der berechnete m/z-Wert betrug 1285,94), wurden innerhalb von (a,c) gezeigt; Die Massenpeaks mit m/z 1272,83, 1272,82 entsprechen dem [M+2H]2+-Ion des VK21-Peptids mit einem Cys-SO2H und zwei CAM-Cysteinen (der berechnete m/z-Wert betrug 1273,44) wurden innerhalb von b gezeigt, D. Die N- und C-terminalen Fragmentionen an einer Peptidbindung sind in der Abbildung jeweils mit b und y gekennzeichnet. Die b5- und b4-Ionen zeigten deutlich, dass Cys355 in R-NHase-(BA)P14K und R-NHase-(BAP14K) zur Sulfinsäure oxidiert wurde, nicht jedoch in apo-NHase-(BA)P14K und apo-NHase-( BAP14K). b* bedeutet ein Ion vom b-Typ nach der Desaminierung und y* bedeutet ein Ion vom y-Typ nach der Desaminierung.

Es wurde bestätigt, dass der Einbau von Kobalt in die NHase von P. putida vom Austausch der α-Untereinheit zwischen der kobaltfreien α-Untereinheit der Apo-NHase und der kobalthaltigen α-Untereinheit von α(P14K) abhängt212 (Abb. 6a). Für die Fusions-NHasen war P14K auch für die Aktivierung der Fusions-NHasen erforderlich, und es wurde festgestellt, dass Kobaltionen in vitro von α(P14K)2 in die Fusions-NHasen übertragen wurden (Tabelle 1). Es ist unwahrscheinlich, dass es zu einem Austausch der α-Untereinheit zwischen den Fusions-NHasen und α(P14K)2 kommt, da die α-Untereinheit mit der β-Untereinheit als ein Polypeptid in der Fusions-NHase fusioniert ist. Daher ist es wahrscheinlich, dass das Kobaltion in der α-Untereinheit von α(P14K)2 direkt in die α-Untereinheitsdomäne der Fusions-NHasen übertragen wurde. In diesem Prozess fungierte α(P14K)2 wahrscheinlich als Metallochaperon für den Kobaltionentransfer. Das Kobaltion wurde zwischen denselben beiden α-Untereinheiten übertragen.

Vorgeschlagener Mechanismus des Kobalt-Einbaus in die Fusions-NHase.

(a) Austausch der Selbstuntereinheit zum Einbau von Kobalt in die Wildtyp-NHase. (b) Kobalttransfer von α(P14K)2 auf Apo-NHase-(BA)P14K in vitro. Die Apo-α-Untereinheit in Apo-NHase-(BA)P14K nähert sich der Erkennungsstelle (Bindungsstelle) von P14K und bindet diese während des Selbst-Untereinheitsaustauschs11 und dann die β-Untereinheit (von Apo-NHase-(BA)P14K) und die Die kobalthaltigen α-Untereinheiten (von α(P14K)2) werden durch die elektrostatische Wechselwirkung angezogen und verbinden sich miteinander, um einen Zwischenkomplex zu bilden. Anstelle des Austauschs der α-Untereinheiten zwischen den beiden Proteinen findet ein direkter Kobaltionentransfer statt. Die Oxidation der beiden Cysteine ​​ist für die Kobaltbindung verantwortlich, was zu aktivem NHase-(BA)P14K führt. (c) Einbau von Kobalt in die Fusion Apo-NHase-(BA)P14K in vivo. P14K kontaktiert direkt die α-Untereinheitsdomäne des Fusions-βα-Proteins, da die Bindungsstellen in der α-Untereinheit aufgrund der Fusion frei sind, was zu einem Zwischenkomplex für die Kobaltinsertion und die Oxidation der beiden Cysteine ​​führt. In diesen Modellen wird ein Fusions-βα-Protein verwendet, um Apo-NHase-(BA)P14K zu zeigen, die Änderung der Position der beiden Arginine wird verwendet, um die weitere Faltung nach dem Einbau von Kobalt zu demonstrieren.

Metallionen in Fe-NHase und Co-NHase befinden sich in ihren α-Untereinheiten, die ein charakteristisches Metallbindungsmotiv (CXLC(SO2H)SC(SOH)) teilen, das zwei oxidierte Cysteinreste enthält: Cysteinsulfinsäure (Cys-SO2H). ) und Cystein-Sulfensäure (Cys-SOH)4,28,29,30. Die oxidierten Cysteinreste sind für die NHase-Aktivität essentiell9,31, was darauf hinweist, dass die beiden Cysteinreste in den Fusions-NHases oxidiert werden sollten. Es wurde festgestellt, dass die entsprechenden zwei oxidierten Cysteinreste in der α-Untereinheit von αe2 vorhanden sind (dem Komplex, der für den Austausch der Selbstuntereinheiten von L-NHasen in R. rhodochrous J1 verwendet wird)9, was darauf hindeutet, dass die beiden Cysteinreste in α(P14K) 2 sollte oxidiert sein. Metallochaperone sind metallbindende Proteine, die dazu dienen, das entsprechende Metallion oder den Metall-Cofaktor an ihre hochspezifischen Ziele zu liefern3. Das Metallion oder der Metall-Cofaktor wird normalerweise zwischen zwei verschiedenen Proteinen übertragen und die Übertragung hängt von der Spezifität und Affinität des Liganden für das Metallion oder den Metall-Cofaktor ab, wie z. B. Kupfermetallochaperon, das Kupferionen auf ATPase und Superoxiddismutase überträgt32,33,34,35 und Nickel-Metallochaperone, die Nickelionen auf Urease und Hydrogenase übertragen36,37,38. Während dieser Prozesse sind die Kupfer-Metallochaperone völlig anders als ATPase und Superoxiddismutase und die Nickel-Metallochaperone völlig anders als Urease und Hydrogenase. Die Zielproteine ​​sollten eine höhere Ligandenspezifität und -affinität als Metallochaperone aufweisen. Obwohl es sich bei α(P14K)2 und NHase um zwei verschiedene Proteine ​​handelt, haben die α-Untereinheiten in α(P14K)2 und in der Fusions-NHase die gleiche Aminosäuresequenz und sollten über die gleichen Kobaltionenliganden verfügen. Daher haben wir ein Metallionentransfermuster für die Metalloproteinbiosynthese entdeckt, bei dem ein Metallion zwischen denselben Proteinuntereinheiten in verschiedenen Proteinkomplexen transportiert wird.

Es ist rätselhaft, dass die Kobaltionen innerhalb desselben Proteins mit derselben Ligandenumgebung übertragen werden. Dieses Phänomen hängt möglicherweise mit der Struktur des aktiven Zentrums von NHase zusammen. Das posttranslational oxidierte Cys-SO2H und Cys-SOH weisen deprotonierte Cys-SO2−- bzw. Cys-SO−-Strukturen auf, und das deprotonierte Cys-SO2− und Cys-SO− in der α-Untereinheit bilden Salzbrücken mit zwei Argininmolekülen die β-Untereinheit der NHase (Abb. S2)9. Nur die elektrostatische Kraft ist für den Salz-auslösenden Austausch der Selbstuntereinheiten erforderlich9. Die entsprechenden Salzbrücken sollten in α(P14K)2 nicht vorhanden sein, da P14K kürzer als die β-Untereinheit ist und das entsprechende Arginin fehlt (Abb. S3). Die Salzbrücken beeinflussten wahrscheinlich die Ligandenumgebung des Kobaltions, was zu einer höheren Affinität für das Kobaltion führte. Wenn daher α(P14K)2 mit den Fusions-NHasen gemischt wird, wird das Kobaltion von der α-Untereinheit von α(P14K)2 auf die α-Untereinheitsdomäne der Fusions-NHasen übertragen. Der Kobalttransferprozess ist aufgrund der Cysteinoxidationsfunktion des Chaperons, das die Selbstuntereinheit austauscht, mit der Cysteinoxidation verbunden9. Ein solcher Vorgang ist in Abb. 6b dargestellt.

Während die Apo-NHase-(BA)P14K durch α(P14K)2 bis zu 50 % der Fusions-NHasen aktiviert wurde, wurde Apo-NHase-(BA) nur bis zu 30 % der Aktivität aktiviert (Tabelle 1). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass sich die Struktur von apo-NHase-(BA)P14K von der von apo-NHase-(BA) unterscheiden könnte und dass apo-NHase-(BA)P14K besser für den Kobaltinbau durch α(P14K)2 geeignet ist . Der Unterschied zwischen apo-NHase-(BA) und apo-NHase-(BA)P14K liegt in der Anwesenheit oder Abwesenheit des P14K-Gens, was darauf hindeutet, dass Protein P14K die Fusions-NHase-Struktur beeinflusst, und wir können spekulieren, dass P14K wahrscheinlich auch als a fungiert molekulares Chaperon für die NHase-Faltung.

Obwohl das Kobaltion in vitro von α(P14K)2 in die Fusions-NHasen übertragen wurde (Tabelle 1), sollte dieser Prozess in vivo nicht stattfinden, da α(P14K)2 in einer Zelle nicht gebildet werden kann, da die β- und α- Untereinheiten werden zu einem Protein verschmolzen. Da P14K für die Aktivierung der Expression von Fusions-NHase notwendig ist und als molekulares Chaperon für die NHase-Faltung fungiert, haben wir einen posttranslationalen Prozess für NHase-(BA)P14K in vivo vorgeschlagen. Wie in Abb. 6c gezeigt, kontaktiert P14K nach der Translation der BA- und P14K-Gene die α-Untereinheitsdomäne des Fusions-βα-Proteins und ein Kobaltion wird mit Hilfe von P14K in die α-Untereinheitsdomäne eingefügt. Die Proteinfaltung erfolgt mit Hilfe von P14K nach dem Einbau von Kobalt, was zur Bildung funktioneller Fusions-NHase führt. P14K dissoziiert während des posttranslationalen Prozesses von der Fusions-NHase25. In diesem Prozess fungiert P14K wahrscheinlich als Apoprotein-spezifisches molekulares Chaperon3 für den Einbau von Kobalt in die Fusions-NHasen wie GroEL, Hsp70 und Hsp40, die an eine Vielzahl von Proteinen binden und Fehlfaltungen verhindern oder deren Rückfaltung stimulieren39.

Da P14K zunächst mit der α-Untereinheitsdomäne des fusionierten βα-Proteins in Kontakt gebracht wird, um Kobalt in die Fusions-NHases einzubauen, stellt sich die Frage, warum dieser Prozess in der Wildtyp-NHase nicht stattfinden konnte. P14K und andere Chaperone, die sich selbst Untereinheiten austauschen, weisen eine signifikante Sequenzähnlichkeit mit der entsprechenden NHase-β-Untereinheit auf (ca. 30 % Homologie) (Abb. S3) und beide sind mit der α-Untereinheit verbunden. Die β-Untereinheit und P14K könnten die gleichen Bindungsstellen in der α-Untereinheit haben. Während des posttranslationalen Prozesses der Wildtyp-NHase kommt es zu einer Konkurrenz um die Bindung der α-Untereinheit. Infolgedessen werden sowohl Apo-NHase als auch α(P14K)2 gebildet, gefolgt vom Austausch der Selbstuntereinheiten für die NHase-Biosynthese. In diesem Fall konnte P14K nicht an die βα-Untereinheit binden, da die Bindungsstellen der α-Untereinheit durch die β-Untereinheit besetzt sind. Bei der NHase-(BA)P14K wird die β-Untereinheit mit der α-Untereinheit fusioniert und die Bindungsstellen der α-Untereinheit werden frei. Daher bindet P14K direkt an die Bindungsstellen der α-Untereinheit des Fusions-βα für den Kobaltinbau.

Wir haben herausgefunden, dass der Einbau von Kobalt in die meisten Co-NHasen vom Austausch der Selbstuntereinheiten sowohl in vitro als auch in vivo abhängt9,11, wohingegen das Kobaltion in der α-Untereinheit von α(P14K)2 direkt in die übertragen wird α-Untereinheitsdomäne der Fusions-NHasen anstelle des Selbstaustauschs der Untereinheiten in vitro (Tabelle 1). Daher stellt sich eine weitere Frage, warum der direkte Transfer nicht während der Biosynthese der Wildtyp-NHase erfolgen konnte. Es ist möglich, dass beide Mechanismen im Wildtyp-NHase-Biosyntheseprozess auftreten; Der vorherige Mechanismus wäre der Austausch von Selbstuntereinheiten. Die Bindung von Kobalt an die α-Untereinheit ist stärker als die Bindung von Chaperon, das die eigene Untereinheit austauscht, an die α-Untereinheit, sodass der Austausch der α-Untereinheit einfacher ist als der direkte Transfer von Kobalt. Obwohl beide Mechanismen im Wildtyp-NHase-Biosyntheseprozess auftreten, könnte daher der Austausch von Selbstuntereinheiten vor dem direkten Cobalttransfer erfolgen. Der Standby-Mechanismus des Kobalt-Direkttransfers könnte eine Teilfunktion für den Kobaltineinbau haben. Infolgedessen werden Apo-NHase-(BA)P14K und Apo-NHase-(BAP14K) durch α(P14K)2 nur teilweise aktiviert (Tabelle 1). Darüber hinaus spielt das Chaperon, das die Selbstuntereinheit austauscht, eine wichtige Rolle beim Einbau von Kobaltionen in die α-Untereinheit. Es wurde berichtet, dass die Flexibilität der C-terminalen Domäne von P14K einer der Schlüsselfaktoren für den Kobaltinbau in die α-Untereinheit ist40; Die von den Genen BP14KA und P14KBA kodierten Fusions-NHasen würden die Flexibilität der C-terminalen Domäne von P14K beeinträchtigen, da sich in der C-terminalen Domäne von P14K eine α- oder β-Untereinheit befindet, die die Flexibilität verringert. Dies könnte ein Grund dafür sein, dass die beiden Fusions-NHasen eine geringere Aktivität zeigten.

Die Genfusion zwingt ein Proteinpaar im Wesentlichen dazu, dauerhaft miteinander zu interagieren, und das Fusionsereignis tendiert dazu, den Zusammenbau zu optimieren, indem es die Proteinkomplextopologien vereinfacht23. Hier haben wir durch eine Genfusionsstrategie zwei Fusions-NHasen mit überlegenen Eigenschaften konstruiert. Der Mechanismus für den Einbau von Kobalt wurde im Zuge dieser molekularen Entwicklung in vivo verändert und wir entdeckten ein Metallionentransfermuster, das in vitro zwischen denselben Proteinen auftritt, was ein unerwartetes Verhalten eines Metallochaperons offenbarte. Der Mechanismus des Kobalt-Einbaus in NHase ist fantastisch und variabel und die Details sollten weiter untersucht werden.

Das P. putida-Wildtyp-NHase-kodierende Gen ABP14K wurde von P. putida12 erhalten. Als Vektoren wurden die Plasmide pET-24a (+) und pET-28a (+) und zur Überexpression E. coli BL21 (DE3) verwendet.

Die in dieser Studie verwendeten Oligonukleotidprimer sind in Tabelle S1 aufgeführt. Das Plasmid pET24a-BAP14K wurde als Matrize verwendet und B-Nde I-up- und P-Hind III-down-Primer wurden für die Einführung von Nde I- bzw. Hind III-Restriktionsstellen entworfen. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde mit einem PCR-Reinigungskit (Promega) gereinigt und mit Nde I und Hind III verdaut, in die Nde I- und Hind III-Stellen von pET-28a (+) ligiert, dann in E. coli JM109 transformiert und sequenziert. Bei korrekter Sequenz wurde der Plasmidextrakt aus E.coli JM109 in E.coli BL21 (DE3) transformiert. Die rekombinanten Plasmide (pET28a-(BA)P14K und pET28a-(BAP14K)) wurden durch ein Overlap-Extension-PCR-Protokoll basierend auf pET28a-BAP14K konstruiert. Um pET28a-(BA)P14K und pET28a-(BAP14K) zu konstruieren, wurden die Primerpaare Linker1-up und Linker1-down verwendet, um die β- und α-Untereinheiten zu verbinden, und Linker2-up und Linker2-down wurden verwendet, um α- und zu verbinden P14K-Untereinheiten. Als nächstes wurde pET28a-(BA) mit den Primerpaaren B-Nde I-up und A-Hind III-down amplifying (BA) aus pET28a-(BA)P14K konstruiert, und das PCR-Produkt und pET-28a (+) waren beide nach 4 Stunden mit Nde I und Hind III verdaut. Das gereinigte DNA-Fragment wurde dann in die Nde I- und Hind III-Stellen von pET-28a (+) ligiert. Die rekombinanten Plasmide (pET28a-(BP14KA) und pET28a-(P14KBA)) wurden jeweils durch ein Overlap-Extension-PCR-Protokoll basierend auf pET28a-(BA) mit den PCR-Produkten P14K-1 und P14K-2 als Primer konstruiert. Das PCR-Produkt P14K-1 wurde mit den Primerpaaren B(P)A-up und B(P)A-down und P14K-2 mit den Primerpaaren (P)BA-up und (P)BA-down amplifiziert mit dem pET24a-BAP14K als Vorlage.

Die rekombinanten E. coli zur Expression des Enzyms wurden zunächst in 10 ml flüssigem 2YT-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin bei 37 °C kultiviert und dann in 500 ml flüssigem 2YT-Medium in einem 2-Liter-Kolben mit 50 μg/ml kultiviert Kanamycin bei 37°C unter Schütteln bei 200 U/min. Als die optische Dichte der Kultur bei 600 nm (OD600) 0,8 erreichte, wurde Isopropyl-β-D-1-Thiogalactosid (IPTG) bis zu einer Endkonzentration von 0,4 mM zugegeben, um die NHase-Expression zu induzieren, und CoCl2.6H2O wurde bis zu einer Endkonzentration zugegeben von 0,05 g/l, um reifes NHase zu erhalten. Anschließend wurde die Kultur 16 Stunden lang bei 24 °C inkubiert.

Alle Reinigungsschritte wurden bei 0–4 °C durchgeführt. Die Zellen wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 6.000 × g geerntet, in 10 mM KPB (enthaltend 0,5 mM Dithiothreitol, pH 7,4) resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung auf Eis lysiert. Die Überstände wurden durch 15-minütige Zentrifugation bei 15.000 × g entfernt und durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,22 μm filtriert. Zur Reinigung von Proteinen ohne Markierung wurde eine DEAE-Sephacel-Säule (3 × 5 ml) (GE Healthcare UK Ltd.) verwendet. Zunächst wurde die Säule mit 10 mM KPB äquilibriert und das Protein mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M KCl in KPB eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, durch Ultrafiltration auf 1 ml konzentriert und auf eine SuperdexTM 200 10/300 GL-Säule (GE Healthcare UK Ltd.) aufgetragen und mit 10 mM KPB bei einer Flussrate von 0,5 ml/min äquilibriert. Zur Reinigung von His-markierten Enzymen wurde das Filtrat unter Verwendung eines AKTA-Reinigers (GE Healthcare, Houston, TX) auf eine HisTrap HP-Chromatographiesäule (GE Healthcare) aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer A (50 mM Phosphatpuffer, 0,3 M NaCl und 20 mM Imidazol, pH 7,4) äquilibriert und die gebundenen Proteine ​​wurden mit Puffer B (50 mM Phosphatpuffer, 0,3 M NaCl und 500 mM Imidazol, pH 7,4) eluiert. . Ebenso wurde zur Reinigung von Strep-markierten Enzymen eine StrepTrap HP-Säule (GE Healthcare UK Ltd.) mit Bindungspuffer (20 mM Na2HPO4·12H2O, 280 mM NaCl, 6 mM KCl, pH 7,4) äquilibriert. Nachdem wir den Überstand auf die Säule injiziert und eine halbe Stunde lang inkubiert hatten, eluierten wir die Proteine ​​mit Elutionspuffer (Bindungspuffer mit 25 mM Desthiobiotin, pH 7,4). Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und der nächste Schritt der Gelfiltration war der gleiche wie oben erwähnt. Die gereinigten Proteine ​​wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) analysiert und die Proteinkonzentration wurde mit der Bradford-Methode quantifiziert41.

Um die Molekülmassen und Strukturen von NHasen zu bestimmen, wurden die gereinigten Enzyme und Markerproteine ​​auf eine SuperdexTM 200 10/300 GL-Säule (GE Healthcare UK Ltd.) aufgetragen. Die Molekülmassen wurden aus der Standardkurve der Markerproteine ​​durch Extrapolation berechnet. Aus den Molekülmassen wurde über die Struktur von Enzymen spekuliert.

Die NHase-Aktivität wurde anhand der Produktzunahme gemessen. Die Reaktionsmischung (0,5 ml) enthielt 10 mM KPB (pH 7,4), 200 mM 3-Cyanopyridin und 10 μl der entsprechenden Menge der Enzymlösung. Die Reaktion wurde 10 Minuten lang bei 25 °C durchgeführt und durch Zugabe von 0,5 ml Acetonitril gestoppt. Die Menge des gebildeten Produkts wurde durch Messung der Absorption bei 215 nm und Extrapolation aus einer Standardkurve bestimmt. Eine Einheit (U) NHase-Aktivität ist definiert als die Enzymmenge, die unter diesen Testbedingungen 1 μmol Nicotinamid pro Minute freisetzt.

Die gereinigten Enzyme (0,5 mg/ml) wurden mit einem Shimadzu AA-7000 Atomabsorptionsspektrophotometer unter den folgenden Bedingungen analysiert: Wellenlänge 240,73 nm; Lampenstrom, 12 mA; und Spaltbreite 0,2 nm. Die Menge an Kobaltionen in den gereinigten Enzymen wurde durch Extrapolation aus einer Standardkurve berechnet.

UV-V-Spektren wurden mit einem U-3900-Spektrophotometer (Hitachi, Tokio, Japan) bei Raumtemperatur erhalten. Enzyme wurden gegen 10 mM KPB (pH 7,5) dialysiert und 1,0 mg/ml-Proben hergestellt.

Die kinetischen Parameter (Km, Vmax, kcat) von BAP14K und den Fusionsproteinen wurden in 10 mM KPB bei 25 °C bestimmt und die Enzymkonzentration betrug 0,2 mg/ml. Die Konzentrationen an 3-Cyanopyridin betrugen 10, 20, 50, 100 und 200 mM und die Reaktion wurde nach 2 Minuten mit Acetonitril beendet. Statistische Analysen wurden mit dem Softwarepaket Graphpad Prism 5 durchgeführt.

Um die thermische Stabilität zu bestimmen, haben wir die gereinigten Enzyme 40 Minuten lang bei 50 °C inkubiert und ihre Aktivität alle zehn Minuten gemessen. Die Methode zur Aktivitätsbestimmung war wie oben erwähnt.

Die Produkttoleranz wurde durch die Abnahme von 3-Cyanopyridin in Gegenwart von 0,5 M Nicotinamid dargestellt und ohne Nicotinamid wurde als Kontrolle verwendet. Um die Produkttoleranz der Rekombinasen zu vergleichen, haben wir die Reduktion von 3-Cyanopyridin in den Mischungen mit und ohne Nicotinamid bestimmt.

Der optimale pH-Wert für die Enzymaktivität wurde bestimmt, indem der Test in pH-Puffern (KH2PO4, 3,893 g/l; C6H8O7·H2O, 6,008 g/l; H2BO3, 1,769 g/l und Barbital-Na2, 5,266) (pH 6,0 bis 11.0). Der pH-Wert mit der höchsten Aktivität wurde als optimaler pH-Wert definiert und die höchste Aktivität wurde als 100 % angenommen.

Zirkulardichroismus-Spektren (CD-Spektren) wurden mit einem MOS-450/AF-CD-STP-A (Bio-Logic, Grenoble, Frankreich) mit einer Quarzküvette mit 1 cm Weglänge und einer Proteinkonzentration von 0,2 mg/ml Zoll gesammelt 10 mM KPB. Das Spektropolarimeter und die Xenonlampe wurden vor den Experimenten 30 Minuten lang aufgewärmt. Wir haben die Elliptizität zwischen 190 und 250 nm gemessen und das Spektrum eines Pufferrohlings davon abgezogen. Wir haben die Online-Methode K2D3 auf einem öffentlich zugänglichen Webserver unter http://k2d3.ogic.ca/ verwendet, um die Sekundärstrukturtypen vorherzusagen. Diese Methode verbessert die Vorhersagen, insbesondere für das Wellenlängenintervall zwischen 200 und 240 nm und für den Beta-Strang-Gehalt42.

In einer früheren Studie konnte der Aktivator P14K mit der α-Untereinheit in Form des Heterotrimers α(P14K)2 vorliegen und stabil existieren, wenn ein Strep-Tag an den N-Terminus von P14K12 angefügt wurde. Daher verwendeten wir pET24a-StrepP14K zur Herstellung von α(StrepP14K)2. Das Apo-Protein wurde in Abwesenheit von Kobalt kultiviert. Umgekehrt wurde das kobalthaltige Protein in Gegenwart von Kobalt kultiviert. Die gereinigte Apo-NHase (0,1 mg/ml) wurde mit dem gereinigten kobalthaltigen α(StrepP14K)2 (0,8 mg/ml) gemischt, gefolgt von einer Inkubation in 10 mM KPB (enthaltend 0,5 mM Dithiothreitol, pH 7,4) bei 25 °C . Als Kontrolle wurde die gereinigte Apo-NHase auf die gleiche Weise mit Kobaltionen (20 μM) gemischt.

Zur Bestimmung der Molekülmasse der fusionierten Untereinheit wurde ein MALDI-TOF-Massenspektrometer (ultrafleXtreme, Bruker Daltonics) verwendet. Die kürzlich eingeführten MALDI-TOF-Massenspektrometer ermöglichen die Aufnahme hochwertiger Fragmentionenspektren von Biomakromolekülen durch laserinduzierte Fragmentierung (LID). Zuerst wurde die Matrix (7,6 mg 2,5-Dihydroxyacetophenon wurde in 375 μl Ethanol verdünnt und 125 μl einer 18 mg/ml Ammoniumdihydrogencitratlösung hinzugefügt) hergestellt und 2 μl Matrix, 2 μl 2 % TFA-Lösung und 2 μl Probe (5 mg/ml) wurden gemischt. Die Probenlösung wurde mit Pipettenspitzen vollständig gemischt, bis die Kristallisation beobachtet werden konnte. Die 0,5-μl-Probenlösung wurde auf eine polierte Zielplatte aus rostfreiem Stahl getüpfelt und getrocknet. Die Quantifizierung der Massensignale wurde mit der FlexAnalysis-Software durchgeführt.

Die Probenbehandlung erfolgt nach einem häufig verwendeten Protokoll43. Kurz gesagt, die Probenlösung wurde zunächst in 8 M Harnstoff denaturiert, wobei Disulfidbindungen durch Dithiothreitol reduziert wurden und alle Cysteinreste durch Iodacetamid carboxamidomethyliert wurden. Anschließend wurde die Probe durch Dialyse gereinigt und mit TPCK-Trypsin (Promega) im Aufschlusspuffer (100 mM Ammoniumbicarbonat, pH 8,5) aufgeschlossen. Die Peptide aus dem Aufschluss wurden in einem SpeedVac-Gerät (Thermo) vollständig getrocknet. Die getrocknete Probe wurde dann in der Probenlösung (2 % Acetonitril, 0,5 % Ameisensäure und 97,5 % Wasser) erneut aufgelöst. Anschließend wurde eine gelöste Peptidprobe mit einem NanoLC-ESI-MS/MS-System analysiert.

Die NanoLC-ESI-MS/MS-Analyse verdauter Proteinproben wurde mit einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem (HPLC) (Agilent) mit einer Umkehrphasen-C18-Säule mit einem Innendurchmesser von 75 Mikrometern und einer Länge von 8 cm durchgeführt. Die Injektionszeit betrug 20 Minuten. Das HPLC-Lösungsmittel A bestand aus 97,5 % Wasser, 2 % Acetonitril und 0,5 % Ameisensäure und Lösungsmittel B bestand aus 9,5 % Wasser, 90 % Acetonitril und 0,5 % Ameisensäure. Die Gradationszeit betrug 100 Minuten von 2 % Lösungsmittel B auf 90 % Lösungsmittel B, plus 20 Minuten für die Probenbeladung und 20 Minuten für das Waschen der Säule. Die Säulenflussrate betrug nach der Spaltung etwa 800 Nanoliter pro Minute. Das typische Injektionsvolumen betrug 3 μl. Das HPLC-System war online mit einem LTQ-Massenspektrometer (Thermo) gekoppelt, sodass eine aus der HPLC-Säule eluierte Probe durch einen Elektrospray-Ionisationsprozess (ESI) direkt ionisiert und in das Massenspektrometer gelangte. Die Ionisationsspannung wurde jedes Mal optimiert und liegt normalerweise im Bereich von 1,2 kV–1,8 kV.

Zitierweise für diesen Artikel: Xia, Y. et al. Konstruktion einer Untereinheit-Fusion-Nitrilhydratase und Entdeckung eines innovativen Metallionentransfermusters. Wissenschaft. Rep. 6, 19183; doi: 10.1038/srep19183 (2016).

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Diese Arbeit wird finanziell unterstützt vom National High Technology Research and Development Program of China (863 Program, 2014AA021304), den Fundamental Research Funds for the Central Universities (JUSRP51411B), der National Natural Science Foundation of China (31300087) und der Natural Sciences Foundation of Jiangsu (BK20130131, BK20130139), ein vom Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions finanziertes Projekt, das 111-Projekt (Nr. 111-2-06), das „Collaborative Innovation Center for Advanced Industrial Fermentation“ der Provinz Jiangsu zur Branchenentwicklung Programm.

Schlüssellabor für industrielle Biotechnologie, Bildungsministerium, Fakultät für Biotechnologie, Jiangnan-Universität, Wuxi, 214122, China

Yuanyuan Xia, Wenjing Cui, Zhongmei Liu, Li Zhou, Youtian Cui und Zhemin Zhou

Institut für Angewandte Biochemie und Graduiertenschule für Lebens- und Umweltwissenschaften, Universität Tsukuba, 1-1-1 Tennodai, Tsukuba, 305-8572, Ibaraki, Japan

Michihiko Kobayashi

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YX, WC, führte die Proteinreinigung durch. YX, WC, ZL, LZ und YC führten die enzymatischen In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen durch. YX, WC, XZ und RS analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. MK und ZZ leiteten die Forschung. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Xia, Y., Cui, W., Liu, Z. et al. Konstruktion einer Untereinheit-Fusion-Nitrilhydratase und Entdeckung eines innovativen Metallionentransfermusters. Sci Rep 6, 19183 (2016). https://doi.org/10.1038/srep19183

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Eingegangen: 14. Mai 2015

Angenommen: 07. Dezember 2015

Veröffentlicht: 12. Januar 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep19183

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Molekularbiologische Berichte (2019)

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