Die Aktivierung von Cofilin 1 verhindert die durch extrazelluläres Alpha verursachten Defekte in der Axonverlängerung und -führung

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 16524 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Eine beeinträchtigte adulte Neurogenese und traumatische Axonverletzungen tragen zur Schwere neurodegenerativer Erkrankungen bei. Alpha-Synuclein, ein zytosolisches Protein, das an der Parkinson-Krankheit beteiligt ist, kann von Neuronen freigesetzt werden, was darauf hindeutet, dass überschüssiges sezerniertes Alpha-Synuclein eine Rolle bei der Entstehung und Ausbreitung der Pathologie spielt. Hier liefern wir Beweise dafür, dass die langfristige Exposition junger Neuronen gegenüber extrazellulärem Alpha-Synuclein die Axonverlängerung und die Drehung des Wachstumskegels behindert. Wir zeigen, dass der Aktinumsatz und die Bewegungsgeschwindigkeit der Aktinwellen entlang des Axons aufgrund der durch Alpha-Synuclein induzierten Inaktivierung von Cofilin verändert sind. Bei Laserzerstörung von Mikrofilamenten wird die Heilung von Axonen durch die erhöhte Phosphorylierung von Cofilin begünstigt, jedoch zu späteren Zeitpunkten; Der Defekt in der Neuritenverlängerung überwiegt und die Regulierung der Cofilin-Aktivität geht verloren. Wichtig ist, dass eine Überexpression der aktiven Form von Cofilin in Neuronen, die Alpha-Synuclein ausgesetzt sind, die Bewegung von Aktinwellen, die physiologische Axonverlängerung und die Drehung des Wachstumskegels wiederherstellen kann. Unsere Studie deckt die molekulare Grundlage von Alpha-Synuclein-bedingten Defiziten beim Wachstum und der Migration neugeborener Neuronen sowie bei der Verlängerung und Regeneration erwachsener Neuronen auf.

Seltene Formen der Parkinson-Krankheit (PD), die auf Mutationen von Alpha-Synuclein (Syn) oder einer erhöhten Expression von Wildtyp-Syn (wt) zurückzuführen sind, sind durch einen frühen Beginn und eine autosomal-dominante Vererbung gekennzeichnet, was Syn an der Pathogenese der Krankheit beteiligt1,2 . Syn-Spiegel können auch eine Rolle bei der Pathogenese der sporadischen Parkinson-Krankheit spielen; Kürzlich wurden Nukleotidpolymorphismen identifiziert, die stark mit PD assoziiert sind und die Syn-Spiegel beeinflussen, indem sie die Gentranskription oder die mRNA-Stabilität verändern3,4. Der Syn-Nachweis in der Liquor cerebrospinalis und im Plasma5 eröffnete den Weg für die Untersuchung nichtzellautonomer Mechanismen bei der Parkinson-Krankheit. Gesunde dopaminerge Transplantate, die in das Striatum implantiert werden, erleiden eine Degeneration, begleitet von Syn-haltigen Lewy-Körpern, was auf eine mögliche Rolle von sezerniertem extrazellulärem Syn beim Ausbruch der Störung schließen lässt6,7. Eine aktuelle Studie lieferte Hinweise auf die Übertragung von Syn aus einer intrastriatalen Inokulation auf Empfängerzellen, was zur Ausbreitung der Pathologie entlang interneuronaler Schaltkreise führt8. Neben der Zunahme der Syn-Expression und -Freisetzung aufgrund der Multiplikation des Syn-Gens kann jede Form von Hirnverletzung oder Zelltod während der Neurodegeneration die Freisetzung von monomerem zellulärem Syn fördern. In PD-Modellen der Syn-Überexpression gehen dem Verlust dopaminerger Neuronen degenerative Veränderungen in striatalen Axonen und Terminals voraus, was darauf hindeutet, dass die Syn-induzierte Pathologie zuerst die Axone und Terminals betrifft und Zellkörper an einem Absterbemechanismus beteiligt sind. Bestimmte Krankheitsstadien können durch den zeitlichen Verlauf der Veränderungen nachgeahmt werden, die bei mit Syn behandelten Tieren auftreten9.

Allerdings wurden die frühen Defizite in der neuronalen Entwicklung und Funktionalität, die durch das Vorhandensein hoher Mengen an extrazellulärem Syn hervorgerufen werden, noch nicht untersucht.

Die adulte Neurogenese wird durch alterndes Gehirn und neurodegenerative Erkrankungen beeinträchtigt10,11, was den Schweregrad der Pathologie aufgrund des neuronalen Verlusts erhöht. Eine Abnahme der Hippocampus-Neurogenese wurde sowohl bei PD-Patienten als auch bei PD-Tiermodellen festgestellt12,13,14. Axonverlängerung und -führung sind grundlegende Prozesse für die korrekte Migration, Integration und Konnektivität sich entwickelnder Neuronen, Prozesse, die durch den Aktinumsatz und die Aktivität aktinbindender Proteine fein abgestimmt werden.

Eine Wechselwirkung zwischen Syn und Aktin wurde durch eine in zwei neuronalen Zelllinien beobachtete Co-Lokalisierung15 und durch die in D. melanogaster- und C. elegans-PD-Modellen beobachtete Fehlregulation der Aktinspiegel nahegelegt16,17. Es wurde gezeigt, dass Syn in vitro direkt mit Aktin interagiert und die Aktindynamik in lebenden Zellen und Neuronen in Kultur beeinflusst18. Es wurde festgestellt, dass extrazelluläres Monomer-Syn in hoher Dosierung, als A30P-Mutantenform von Syn, die Aktindynamik durch die durch Cofilin-1-Phosphorylierung vermittelte Stabilisierung von Mikrofilamenten beeinträchtigt19. Ein verändertes Gleichgewicht der Cofilin-1-Aktivität aufgrund einer Fehlregulation von Kinasen und Phosphatasen, die den Phosphorylierungszustand von Cofilin 1 steuern, wurde mit Neurodegeneration in Verbindung gebracht. Aufgrund der Inaktivierung von Slingshot-Phosphatasen wurde eine erhöhte Inaktivierung/Phosphorylierung von Cofilin 1 mit zunehmendem Alter und bei der Alzheimer-Krankheit festgestellt. 120 Es wurde gezeigt, dass Amyloid-Beta-Peptid sowohl die Cofilin-Phosphorylierung bei niedrigen Dosen verringert, die Bildung von Aktinstäbchen fördert21 als auch Cofilin durch die Kinase der LIM-Domäne inaktiviert (LIMK)-Signalweg bei höheren Dosen und trägt zur Aktinpolymerisation bei22. Das Fehlen der Leucin-reichen Repeat-Serin/Threonin-Protein-Kinase (LRRK) oder der mutierten LRRK, die nicht in der Lage ist, Proteinkinase A (PKA) zu binden, führt zu einer erhöhten PKA-abhängigen Phosphorylierung von Cofilin, was zu einer abnormalen Synaptogenese und Übertragung führt23.

Hier zeigen wir, dass Hippocampus-Neuronen in Kultur, die extrazellulär verabreichtem wt oder A30P-mutiertem Syn ausgesetzt sind, eine fehlerhafte Axonverlängerung und eine abgestumpfte Drehung des Wachstumskegels aufweisen, während der Aktinumsatz verringert und die Cofilin-1-Aktivität verändert ist. Alle durch Syns verursachten zytoskelettassoziierten Defekte in der Axonentwicklung können durch die Aktivierung von Cofilin 1 verhindert werden. Wir schlagen einen Mechanismus vor, durch den die genaue Verkabelung neuronaler Netzwerke sowohl in sich entwickelnden Neuronen in den Bereichen der adulten Neurogenese als auch in ausgereiften etablierten Verbindungen erfolgt. geht in frühen Stadien der Syn-induzierten Neurodegeneration verloren. Dadurch könnten die Regulationswege von Cofilin 1 ein wirksames Ziel für die Therapie der Parkinson-Krankheit darstellen.

Wir haben zuvor gezeigt, dass Syn die Aktin-Assemblierung physiologisch moduliert, eine Aktivität, die in der Syn-A30P-Mutante stark verändert ist18, und dass hohe Mengen an löslichem extrazellulärem Syns, sowohl in wt- als auch in der A30P-Mutantenform, ebenfalls in der Lage waren, die Aktindynamik zu beeinflussen und Mikrofilamente zu stabilisieren19. Um die chronische Wirkung von Syns im extrazellulären Milieu zu beurteilen, inkubierten wir embryonale Hippocampus-Neuronen unmittelbar nach der Dissektion mit 5 μM gereinigtem humanem rekombinantem wt oder A30P Syn für 2 Tage. Die gereinigten Proteine enthielten keine aggregierten oder gespaltenen Formen und zeigten nach zweitägiger Inkubation mit dem neuronalen Medium das Vorhandensein weniger Oligomere24. Im Vergleich zu Kontrollproben war in Neuronen, die 2 Tage lang in vitro (DIV) extrazellulärem Syns ausgesetzt waren, ein Anstieg der Filopodien und Lamellipodien um den Zellkörper und den Wachstumskegel herum erkennbar (Abb. 1a), was auf eine erhöhte Aktinassemblierung und -stabilisierung hinweist.

Extrazelluläre Syns verringern die mobile Aktinfraktion.

(a) F-Actin-Verteilung, wie durch fluoreszierende Phalloidin-Färbung gezeigt, in 2 DIV-embryonalen Hippocampus-Neuronen von Mäusen, die 2 Tage lang in Abwesenheit oder Anwesenheit von 5 μM gereinigtem wt oder A30P Syn inkubiert wurden. (b) Mit Aktin-YFP infizierte Neuronen wurden entlang des Axons gebleicht (linkes Feld, quadratisch) und bei 3 DIV bei 1 Bild/0,6 s für 60 s abgebildet (rechtes Feld). (c) Mittlere Kurven der Aktin-YFP-Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung im Laufe der Zeit in mit Kontrolle (blau), wt Syn (grün) und A30P Syn (rot) behandelten Neuronen. Beachten Sie den niedrigeren Wert des Plateaus in den Kurven, die von Syns erhalten wurden. behandelte Neuronen. (d) Quantitative Bewertung des Prozentsatzes der mobilen Fraktion an der Gesamtfluoreszenz und der Zeitkonstante der Fluoreszenzwiederherstellung (e) in der Kontrolle und in Neuronen, die wie in (a) mit Syns behandelt wurden. In (d, e) werden die Daten als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. In (c–e), Strg, n = 19, wt Syn, n = 24; A30P Syn, n = 24, aus 3 unabhängigen Kulturen. Statistische Signifikanz bestimmt durch einfaktorielle ANOVA, gefolgt von Dunnett-Test für Mehrfachvergleich, *P < 0,05; **P < 0,01. (d) P = 0,0046, Alpha-Wert: 0,050:0,791; (e) P = 0,5170 ns, Alpha-Wert: 0,050:0,049). Balken in (a, b) 10 μm.

Um zu verstehen, ob der beobachtete Effekt extrazellulärer Syns auf die Morphologie und Dynamik des Zytoskeletts auf eine Zunahme stabilisierter Mikrofilamente zurückzuführen sein könnte, führten wir Experimente zur Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung (FRAP) durch. FRAP wurde an Neuronen bei 3 DIV durchgeführt, die mit Actin-YFP viral infiziert waren. Die Region of Interest (ROI) wurde bei allen untersuchten Neuronen im Zentrum des Axons im gleichen Abstand vom Zellkörper gewählt (Abb. 1b). Die Wiederherstellung der Fluoreszenzintensität nach der Photobleichung wurde nach Normalisierung auf einer Kontrollfläche quantifiziert. Die Zeitkonstante der Fluoreszenzwiederherstellung korreliert mit der Geschwindigkeit der Aktinpolymerisation und das durch die Fluoreszenz erreichte Plateau zeigt den Anteil der Filamente an, die einem aktiven Tretmühlenvorgang unterzogen werden (Abb. 1c). Die Quantifizierung dieser Parameter zeigte, dass in Syns-behandelten Neuronen der mobile Anteil im Vergleich zur Kontrolle um etwa 35 % verringert war (Abb. 1d), obwohl sich die Insertionsrate nicht änderte (Abb. 1e). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Pool an freien Aktinmonomeren gering ist und sich das Gleichgewicht in Richtung eines stabilen, polymerisierten Zustands der Mikrofilamente verschiebt.

Eine Störung oder Stabilisierung des Aktin-Zytoskeletts kann dazu führen, dass die Axone nicht in der Lage sind, sich als Reaktion auf extrazelluläre Signale zu verlängern und zu drehen. Die Chemotaxis-Dunn-Kammer wurde verwendet, um die Reaktion von Neuronen auf einen Gradienten von Chemoattraktoren zu untersuchen. Die äußere Vertiefung enthielt eine Lösung von 20 μM 8-Bromadenosin-3′,5′-zyklischem Monophosphat (8-Br-cAMP), einem PKA-Aktivator ( Abb. 2a). Neuronen wurden vor den Experimenten zwei Tage lang ohne oder mit wt und A30P Syn inkubiert und durch 30-minütige Zeitrafferbildgebung auf ihre Reaktion auf 8-br-cAMP untersucht. Die Analyse der Richtung der Axondrehung in Gegenwart des Lockreizes zeigte, dass, während Kontrollneuronen ihre Wachstumsbahn in Richtung zunehmender Konzentrationen des Chemoattraktors änderten, Syns-behandelte Neuronen die Fähigkeit verloren, Leitreizen zu folgen (Abb. 2b). ). Die Quantifizierung der Wachstumsrichtung der Axone 30 Minuten nach der Anwendung von 8-Br-cAMP zeigt eine 100 % positive Reaktion in Kontrollneuronen und eine 50 % positive Reaktion in Syns-behandelten Neuronen, was auf ein zufälliges Verhalten hinweist (Abb. 2c). Die Wachstumsrate der sich drehenden Axone war auch in mit wt und A30P Syn behandelten Neuronen signifikant verringert (Abb. 2d). Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die durch Syns verursachte Abnahme des Aktinumsatzes mit Funktionsdefiziten in sich entwickelnden Neuronen, wie etwa der Verlängerung und korrekten Migration des Axons, korrelieren könnte.

Extrazelluläre Syns behindern die Axonführung.

(a) Neuronen, die auf einem Deckglas kultiviert wurden, das kopfüber über einer Dunn-Kammer montiert wurde, wobei die äußere Vertiefung mit 40 μM zyklischem 8-br-cAMP gefüllt war, das durch Diffusion einen Gradienten bildet. Neuronen wurden 30 Minuten lang mit 1 Bild/Minute abgebildet, die Bilder werden 0 Minuten und 30 Minuten nach Anwendung des Gradienten angezeigt (grauer Balken oben). (b) Trajektoriendiagramme wachsender Axone, die während der 30 Minuten des Experiments in Strg-, Wt- und A30P-Syn-behandelten Neuronen bei 2 DIV einem Gradienten von Lockstoffreizen ausgesetzt waren. Die Quelle des Chemolockstoffs befindet sich oben in den Diagrammen. Die ursprüngliche Richtung des Axons war an der horizontalen Achse ausgerichtet. (c) Quantitative Bewertung des Prozentsatzes der Axone, die sich in Neuronen, die wie in (b) behandelt wurden, dem Anziehungsgradienten zuwenden. Die Daten der Neuronen jedes Experiments wurden zusammengefasst und eine statistische Analyse durchgeführt, bei der die Daten unabhängiger Experimente verglichen wurden. (d) Quantitative Bewertung der Axonverlängerung während 30 Minuten in Neuronen, die mit oder ohne wt oder A30P Syn behandelt wurden. In (c, d) werden die Daten als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. In (c), Strg, n = 30; wt Syn, n = 17; A30P Syn, n = 18, aus 3 unabhängigen Kulturen. In d ctrl, n = 20; wt Syn, n = 14; A30P Syn, n = 12, aus 3 unabhängigen Kulturen. Die statistische Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA und anschließend den Dunnett-Test für Mehrfachvergleiche bestimmt, *P < 0,05; ***P < 0,001. (c) P = 0,0001, Alpha-Wert: 0,050:1,000; (d) P = 0,0424, Alpha-Wert: 0,050:0,450) Balken in a: 10 μm.

In wachsenden Neuronen wandern Aktinwellen vom Zellkörper zum Wachstumskegel, um das Wachstum des Axons zu erleichtern. Wir verwendeten die Geschwindigkeit von Aktinwellen als Parameter der Neuritendynamik; Tatsächlich sind Aktinwellen in Neuronen im frühen DIV häufiger und schneller. Während der Zeitrafferaufnahme von Neuronen bei 2 DIV waren wachstumskegelartige Strukturen deutlich sichtbar, die vom Zellkörper zur Spitze des Axons wanderten (Abb. 3a). Aktinwellen enthielten Aktin und Cofilin 1, ein Aktin-bindendes Protein, während Mikrotubuli, die im Zentrum des Axons vorhanden sind, in Aktinwellen fehlten (Abb. 3b). Mit oder ohne Syns inkubierte Neuronen wurden mit 1 Bild/2 Minuten abgebildet und die Geschwindigkeit der Aktinwellen wurde bestimmt, indem die Zeit berechnet wurde, die die Welle brauchte, um die Spitze des Wachstumskegels zu erreichen, normalisiert für die Länge des Axons (Ergänzungsvideo 1) . Im Vergleich zu Kontrollproben zeigten Neuronen, die zwei Tage lang extrazellulärem Syns ausgesetzt waren, eine Verringerung der Geschwindigkeit der Aktinwellen um etwa 20 % (Abb. 3c), obwohl sie gesund aussahen und dynamische Wachstumskegel aufwiesen. Wir haben zuvor gezeigt, dass extrazelluläre Syns durch die Inaktivierung von Cofilin 1 indirekt auf die Aktindynamik einwirken und so die Stabilisierung von Aktinfilamenten fördern19. Daher fragten wir uns, ob Cofilin 1 nach chronischer Syns-Exposition in seinem inaktiven Zustand war. Neuronen wurden 2 Tage lang Syns ausgesetzt und der Gehalt an phosphoryliertem, inaktivem Cofilin 1 wurde durch Immunoblot quantifiziert (Abb. 3d). Der Gehalt an phosphoryliertem Cofilin 1 war im Vergleich zur Kontrolle tatsächlich um das 1,8-fache in mit wt Syn inkubierten Neuronen und um das 2-fache in mit A30P Syn inkubierten Neuronen erhöht (Abb. 3e). Die Untersuchung der Lokalisierung von inaktivem Cofilin 1 wurde durchgeführt, indem immunfluoreszierende Phospho-Cofilin-1-Bereiche von den durch fluoreszierendes Cofilin 1 gefärbten Bereichen in Neuronen abgezogen wurden, die 2 Tage lang mit Syns behandelt wurden oder nicht (Abb. 3f). Subtraktionsbilder zeigten Bereiche mit angereichertem Phospho-Cofilin 1, in denen die Färbung fehlte, und insbesondere Aktinwellen zeigten keine Färbung in Syns-behandelten Neuronen (Abb. 3f, mittlere und untere Tafel, Pfeile), was darauf hindeutet, dass durch die Inaktivierung von Cofilin 1 Das Aktin-Zytoskelett verlor seine Dynamik innerhalb der Aktinwellen. Um die Korrelation zwischen der Geschwindigkeit der Aktinwellen und dem Polymerisationszustand des Zytoskeletts weiter zu untersuchen, verwendeten wir Medikamente, die die Aktinassemblierung modulieren. Neuronen wurden 20 Minuten lang Jasplakinolid (Jaspla), einem Stabilisator von Mikrofilamenten, und Latrunculin A (LatA), einem Monomer-Sequestrierungsprotein, ausgesetzt, die Medikamente wurden ausgewaschen und die Neuronen wurden 3 Stunden lang abgebildet. Tatsächlich wurde nach der Behandlung mit Jaspla die Geschwindigkeit der Aktinwellen um 20 % reduziert, ähnlich wie beim Syn-Effekt, und nach der LatA-Behandlung war die Geschwindigkeit der Aktinwellen höher (Abb. 3g), was darauf hindeutet, dass die Depolymerisation die Bewegung der Aktinwellen unterbricht.

In Gegenwart von Syns bewegen sich Aktinwellen langsamer und enthalten eine höhere Konzentration an p-Cofilin 1.

(a) Zeitrafferbilder eines 2 DIV embryonalen Hippocampus-Neurons, die eine Aktinwelle zeigen, die vom Zellkörper zum Wachstumskegel verläuft. Neuronen wurden 3 Stunden lang alle 2 Minuten mit einem Bild abgebildet. (b) Fluoreszenzanalyse eines Neurons bei 2 DIV, gefärbt mit Phalloidin (F-Actin) und Antikörpern gegen Tubulin und Cofilin 1. Actin und Cofilin 1 sind in der Welle vorhanden (Pfeile), während Tubulin ausgeschlossen ist. (c) Quantifizierung der Aktinwellengeschwindigkeit, berechnet an Neuronen, die 2 Tage lang mit oder ohne wt oder A30P Syn behandelt und wie in (a) abgebildet wurden. (d) Repräsentative Immunoblots, die die rechts angegebenen Proteinkonzentrationen in Zellhomogenaten von Neuronen zeigen, die mit oder ohne wt oder A30P Syn behandelt wurden. Actin wird als interner Standard angezeigt. (e) Quantifizierung des Verhältnisses zwischen p-Cofilin-1- und Cofilin-1-Banden, analysiert durch Densitometrie und normalisiert auf Aktinebene, für jede in (d) gezeigte Versuchsbedingung. (f) Fluoreszenzanalyse von Neuronen, die 2 Tage lang mit oder ohne wt oder A30P Syn inkubiert und für Cofilin 1 und p-Cofilin 1 verarbeitet wurden. In den rechten Feldern werden Bilder gezeigt, die aus der Subtraktion der für p-Cofilin 1 gefärbten Fläche von abgeleitet wurden der für Cofilin 1 gefärbte Bereich. (g) Quantifizierung der Geschwindigkeit von Aktinwellen, berechnet an Neuronen, die 20 Minuten lang mit oder ohne 2 μM LatA oder 20 Minuten lang mit 12 nM Jaspla behandelt wurden. In (c, e, g) werden die Daten als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. In c, Strg, n = 59; wt Syn, n = 60; A30P Syn, n = 76, aus 5 unabhängigen Kulturen. In (e) n = 3 unabhängige Experimente. In (g), Strg, n = 74; LatA, n = 20; Jaspla, n = 23, aus 3 unabhängigen Kulturen. Die statistische Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA und anschließend den Dunnett-Test für Mehrfachvergleiche bestimmt, *P < 0,05; **P < 0,01. (c) P = 0,0012, Alpha-Wert: 0,050:0,890; (e) P = 0,0086, Alpha-Wert: 0,050:0,477; (g) P = 0,0012, Alphawert: 0,050:0,897). Balken in (a, f) 10 μm, in (b) obere Reihe 10 μm, untere Reihe 2 μm.

Ein Hirntrauma und eine Schädigung von Neuronen sind Erkrankungen, die die Parkinson-Symptome verstärken. Das Aktin-Zytoskelett ist an der Reparatur und Regeneration verletzter Axone beteiligt. Daher fragten wir uns, ob Syns den Heilungsprozess beeinträchtigen würde. Ein im Subnanosekundenbereich gepulster UVA-Laser wurde verwendet, um auf hochkontrollierte und reproduzierbare Weise eine partielle Läsion von Axonen zu erzeugen. Die geringe Leistung des Lasers (1,8 μW) führte zu einer Ausdünnung des Axons ohne vollständige Ablation der neuronalen Membran (Abb. 4a, roter Fleck und Zusatzvideo 2) und zu einer lokalisierten Störung der drei Elemente des axonalen Zytoskeletts25. Das Axon und der Wachstumskegel, die nach der Läsion geschrumpft waren, kehrten in kurzer Zeit in ihre ursprüngliche Form zurück und in wenigen Minuten begannen sich Aktinwellen über die Läsion zu bewegen und zum Wachstumskegel zu gelangen (Ergänzungsvideo 3). Die Wellengeschwindigkeit im stationären Zustand in Abwesenheit oder Anwesenheit von Syns wurde verwendet, um die Dynamik in verletzten und unverletzten Neuronen zu vergleichen.

Syns begünstigen die Bewegung von Aktinwellen nach einer axonalen Verletzung.

(a) Neuron bei 2 DIV vor (linkes Feld) und nach (mittleres Feld) Verletzung durch UVA-Laser (roter Fleck). In den Feldern rechts ist eine Vergrößerung des Läsionsbereichs vor (oben) und nach (unten) der Verletzung dargestellt. (b) Quantifizierung der Geschwindigkeit von Aktinwellen in verletzten Neuronen, die 2 Tage lang mit oder ohne wt oder A30P Syn behandelt und wie in Abb. 3a abgebildet wurden. (c) Fluoreszenzanalyse (Z-Stapel konfokaler Bilder) embryonaler Hippocampusneuronen vor (linke Felder), nach 20 Minuten mit 2 μM LatA (mittlere Felder) und nach 2 Stunden Auswaschen des Arzneimittels (rechte Felder) und Färbung mit Phalloidin (F-Actin) (rot) und Antikörpern gegen Cofilin 1 (blau) und p-Cofilin 1 (grün). (d) Quantifizierung des Verhältnisses zwischen der Fluoreszenzintensität von p-Cofilin 1 und Cofilin 1 für jede in (c) gezeigte Versuchsbedingung. (e) Repräsentative Immunoblots, die die rechts angegebenen Proteinkonzentrationen in Zellhomogenaten von Neuronen zeigen, die 20 Minuten lang mit oder ohne 2 μM LatA und nach 2 Stunden Auswaschen des Arzneimittels behandelt wurden. Actin wird als interner Standard angezeigt. (f) Quantifizierung des Verhältnisses zwischen p-Cofilin 1- und Cofilin 1-Banden, analysiert durch Densitometrie, für jede in e gezeigte Versuchsbedingung. (g) Quantifizierung der Axonverlängerung während 16 Stunden in Neuronen, die 2 Tage lang mit oder ohne wt oder A30P Syn behandelt und durch UVA-Laser verletzt wurden. In (b, d, f, g) werden die Daten als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. In (b), Strg, n = 30; wt Syn, n = 35; A30P Syn, n = 32, aus 3 unabhängigen Kulturen. In (d) ist n = 5 für jede Bedingung aus 3 unabhängigen Kulturen. In (f) sind n = 3 unabhängige Experimente. In (g), Strg, n = 25; wt Syn, n = 18; A30P Syn, n = 13, aus 4 unabhängigen Kulturen. Die statistische Signifikanz wurde durch eine einfaktorielle ANOVA und anschließend den Dunnett-Test für Mehrfachvergleiche bestimmt, *P < 0,05; **P < 0,01. (b) P = 0,2956, ns, Alpha-Wert: 0,050:0,083; (d) P = 0,0043, Alpha-Wert: 0,050:0,942; (f) P = 0,0316, Alpha-Wert: 0,050:0,683; (g) P = 0,0141, Alphawert: 0,050:0,659). Balken in (a) mittleres Feld, 10 μm, rechtes Feld, 1 μm, in (c) 20 μm.

In Kontrollneuronen führte die Läsion zu einem leichten Rückgang der Geschwindigkeit der Aktinwellen. Unerwarteterweise war die Geschwindigkeit der Aktinwellen nach der Läsion in wt- und A30P-Syn-behandelten Neuronen ähnlich wie bei der Kontrolle (Abb. 4b), jedoch signifikant höher im Vergleich zur Geschwindigkeit der Aktinwellen in Syns-behandelten, nicht verletzten Neuronen (Abb. 3c). ). Es ist denkbar, dass in einem Zustand, in dem Aktin gegen Depolymerisation resistent wird und Mikrofilamente stabilisiert werden, wie es in Gegenwart von Syns der Fall ist, der Pool an Aktinmonomeren, die für das Treten aktiver Filamente benötigt werden, gering ist, was zu einer langsamen Bewegung der Aktinwellen führt. Im Falle einer lokalen Zerstörung der Mikrofilamente, beispielsweise nach einer Verletzung, wird der Monomerpool lokal wiederhergestellt, was eine aktive Polymerisation begünstigt.

Um diese Hypothese zu überprüfen, haben wir Neuronen mit LatA behandelt. LatA, das die Aktin-Depolymerisation induziert, könnte einen Zustand darstellen, der eine Läsion nachahmt, wenn auch nicht lokalisiert, sondern das gesamte Axon betreffend. Wir haben gezeigt, dass die Geschwindigkeit der Aktinwellen bei der LatA-Behandlung höher war (Abb. 3g) und wir haben gefragt, welches das gemeinsame Ziel für Syns und LatA sein könnte, das den Heilungsprozess begünstigen kann. Eine generalisierte Depolymerisation, wie sie durch LatA induziert wird, könnte möglicherweise einen Rückkopplungsmechanismus in den Zellen aktivieren, der auf die Wiederherstellung der Mikrofilamentmorphologie abzielt. Wenn LatA 20 Minuten lang auf Neuronen angewendet wurde, wurde ein Anstieg des Spiegels an phosphoryliertem Cofilin 1 beobachtet, der 2 Stunden nach dem Auswaschen des Arzneimittels wieder auf die Kontrollbedingungen zurückkehrte, was in der Immunfärbung (Abb. 4c, d) und in sichtbar war der Immunoblot von p-Cofilin 1 (Abb. 4e, f). Die Inaktivierung von Cofilin 1, die die Polymerisation von Mikrofilamenten begünstigt, würde den Anstieg der Geschwindigkeit von Aktinwellen in Gegenwart des Arzneimittels erklären, und ähnlich auch in Gegenwart von Syns, nachdem Mikrofilamente durch die laserinduzierte Verletzung depolymerisiert wurden . Die akute Schutzwirkung von Syns aufgrund der Inaktivierung von Cofilin 1 schloss eine mögliche Veränderung der Axonverlängerung nach einer Verletzung zu späteren Zeitpunkten nicht aus. Neuronen wurden nach dem Ausplattieren mit Syns inkubiert, bei 2 DIV wurde das Axon wie oben verletzt und Neuronen wurden 16 Stunden lang abgebildet. Das Axon wurde verfolgt und die Längenzunahme zwischen dem ersten und dem letzten Bild des Films berechnet (Abb. 4g). Tatsächlich war die Dehnung nach der Verletzung und in Gegenwart von Syns 30 % geringer als bei der Kontrolle, was darauf hindeutet, dass die chronische Inaktivierung von Cofilin 1 zwar vorübergehend die Repolymerisation zerstörter Filamente begünstigen könnte, die Regeneration des Axons jedoch zu späteren Zeitpunkten beeinträchtigt.

Um den Phosphorylierungszustand von Cofilin 1 und damit die Stabilisierung des Zytoskeletts mit der Syn-gesteuerten Abnahme der Geschwindigkeit der Aktinwellen zu korrelieren, verwendeten wir dominant negative und positive Cofilin 1-Konstrukte. Neuronen wurden entweder mit Wildtyp-Cofilin 1 oder der nicht phosphorylierbaren S3A-Mutantenform von Cofilin 1, die konstitutiv aktiv ist, oder der pseudophosphorylierten S3E-Mutante, die konstitutiv inaktiv ist, elektroporiert. Neuronen, die mit RFP-markierten Konstrukten von Cofilin 1 elektroporiert wurden, exprimierten das exogene Protein (Abb. 5a, RFP-Cofilin) im Durchschnitt mit dem 2- bis 4-fachen der Menge an endogenem Cofilin 1, wie unter Berücksichtigung der Transfektionseffizienz berechnet, die ~30–40 % betrug %. Die Überexpression von S3A-Cofilin 1 induzierte signifikant schnellere Wellen und das Gegenteil war bei S3E-Cofilin-1-überexprimierenden Neuronen der Fall (Abb. 5b), was auf die Bedeutung der Cofilin-1-Modulation zur Förderung der Aktinwellenmotilität hinweist. Wichtig ist, dass die Überexpression von S3A-Cofilin 1 in Neuronen, die Syns ausgesetzt waren, die Bewegungsgeschwindigkeit der Aktinwellen wiederherstellen konnte (Abb. 5c) und so die Syn-gesteuerte Inaktivierung des Proteins ausgleichen konnte.

Aktives Cofilin 1 verhindert Syn-bedingte Defekte bei der Axonverlängerung und -drehung.

(a) Immunblots, die die rechts angegebenen Proteine in Homogenaten von Neuronen zeigen, die mit RFP-wt-Cofilin oder RFP-S3A-Cofilin oder RFP-S3E-Cofilin oder RFP als Kontrolle elektroporiert wurden. (b) Quantifizierung der Geschwindigkeit von Aktinwellen in Neuronen, die mit Konstrukten wie in (a) elektroporiert wurden. (c) Quantifizierung der Geschwindigkeit von Aktinwellen in Neuronen, die mit RFP- oder RFP-S3A-Cofilin elektroporiert und in Abwesenheit oder Anwesenheit von wt oder A30P Syn für 2 Tage inkubiert wurden. (d) Quantifizierung der Axonverlängerung während 30 Minuten in Neuronen, die mit RFP- oder RFP-S3A-Cofilin elektroporiert und mit oder ohne wt oder A30P Syn behandelt wurden. (e) Quantifizierung des Prozentsatzes der Axone, die sich dem Anziehungsgradienten in Neuronen zuwenden, die wie in (d) elektroporiert und behandelt wurden. Die Daten der Neuronen jedes Experiments wurden zusammengefasst und eine statistische Analyse durchgeführt, bei der die Daten unabhängiger Experimente verglichen wurden. In (b–e) werden die Daten als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde durch einen zweiseitigen T-Test bestimmt. In (b), RFP/S3A, P = 0,0176, Alpha-Wert: 0,050:0,747; RFP/S3E, P = 0,0381, Alphawert: 0,050:0,273; RFP, n = 41; Gew. Cofilin, n = 13; S3A, n = 43; S3E, n = 11, aus 3 unabhängigen Kulturen. In c, RFP/wt Syn, P = 0,0226, Alpha-Wert: 0,050:0,547; RFP/A30P Syn P = 0,0191, Alphawert: 0,050:0,181; Gew. Syn/S3A + Gew. Syn P = 0,0291, Alphawert: 0,050:0,604; A30P Syn/S3A + A30P Syn, P = 0,0135, Alphawert: 0,050:0,421; RFP, n = 43; wt Syn, n = 17; A30P Syn, n = 20; S3A + wt Syn, n = 14; S3A + A30P Syn, n = 27, aus 3 unabhängigen Kulturen. In d, RFP/wt Syn P = 0,0231, Alpha-Wert: 0,050:0,634; RFP/A30P Syn P = 0,0282, Alphawert: 0,050:0,602; Gew.-Syn/S3A + Gew.-Syn, P = 0,0035, Alpha-Wert: 0,050:0,884; A30P Syn/S3A + A30P Syn, P = 0,0426, Alphawert: 0,050:0,540; RFP, n = 33; wt Syn, n = 13; A30P Syn, n = 13; S3A + wt Syn, n = 9; S3A + A30P Syn, n = 10, aus 3 unabhängigen Kulturen. In e wurde die statistische Signifikanz durch eine einfaktorielle ANOVA gefolgt von Dunnetts Test für Mehrfachvergleiche bestimmt, ***P < 0,001, (RFP/wt Syn, RFP/A30P Syn, P = 0,0001, Alphawert: 0,050:1,000) und durch zweiseitigen t-Test: wt Syn/S3A + wt Syn P = 0,0012, Alpha-Wert: 0,050:0,874; A30P Syn/S3A + A30P Syn, P = 0,0044, Alphawert: 0,050:0,688; RFP, n = 43; wt Syn, n = 17; A30P Syn, n = 20; S3A + wt Syn, n = 14; S3A + A30P Syn, n = 27, aus 3 unabhängigen Kulturen.

Basierend auf diesen Ergebnissen und um die Bewegungsgeschwindigkeit der Aktinwellen mit der axonalen Verlängerung zu korrelieren, testeten wir die Fähigkeit von konstitutiv aktivem Cofilin 1, Defekte in der axonalen Wachstumsrate zu verhindern. Mit S3A-Cofilin 1 elektroporierte und wie oben beschrieben 2 Tage lang Syns ausgesetzte Neuronen wurden abgebildet und die Länge des Axons nach 30 Minuten berechnet. Die Exposition von scheintransfizierten Neuronen gegenüber wt und A30P Syn führte zu einer signifikanten Abnahme der Axonverlängerung, wie sie bei nicht transfizierten Neuronen beobachtet wurde (Abb. 2d). Die Expression von aktivem Cofilin 1 konnte die physiologische Wachstumsrate in Gegenwart von wiederherstellen Syns (Abb. 5d).

Um die Korrelation zwischen der Wirkung von Syn auf die Cofilin-Aktivität, der daraus resultierenden Veränderung der Dynamik des Zytoskeletts und der Drehung des Wachstumskegels zu bestätigen, untersuchten wir außerdem die Fähigkeit von aktivem Cofilin 1, die Reaktion des Axons auf Lockstoffe wiederherzustellen, die in verloren gegangen war Vorhandensein extrazellulärer Syns. Scheintransfizierte oder S3A-Cofilin 1 exprimierende Neuronen wurden in der Dunn-Kammer nach Erzeugung eines Gradienten von 8-Br-cAMP analysiert. Während sich nur 50 % der mit Syns inkubierten RFP-exprimierenden Neuronen zufällig dem Lockstoff-Signal zuwandten, stellte die Expression von S3A-Cofilin 1 die korrekte Reaktion wieder her und 80–100 % der Axone konnten sich dem Gradienten folgen (Abb. 5e).

Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse auf die Möglichkeit hin, die Wirkung des Syn-Effekts auf sein Zielprotein Cofilin 1 zu verhindern und die Fähigkeit von Neuronen wiederherzustellen, sich zu verlängern und in Richtung ihres Ziels zu wandern.

In dieser Studie liefern wir Beweise dafür, dass extrazellulär freigesetztes Syn zu den Defiziten in der Axonverlängerung und -führung beiträgt, die der Beeinträchtigung der neuronalen Entwicklung und Regeneration nach einer Verletzung zugrunde liegen und zur Schwere neurodegenerativer Erkrankungen wie Parkinson beitragen.

Wir haben zuvor gezeigt, dass die Aktindynamik durch das Vorhandensein von überschüssigem wt oder A30P Syn im extrazellulären Milieu beeinflusst wird, was zu einer Stabilisierung der Mikrofilamente führt 19 . Hier zeigen wir, dass die langfristige Exposition von Neuronen gegenüber extrazellulären Syns mit einem verringerten Aktinumsatz korreliert, was durch den geringen Prozentsatz an mobilem Aktin entlang des Axons angezeigt wird. Neuronen schienen mit Aktinstrukturen angereichert zu sein, mit großen Lamellipodien um den Zellkörper und an der Neuritenspitze, was an die Wirkung erinnert, die durch aktinstabilisierende Medikamente hervorgerufen wird.

Vervielfachungen des Syn-kodierenden Gens treten im frühen PD2-Gen auf,26,27, und durchweg wirkten hohe Konzentrationen von wt-Syn ähnlich wie A30P-mutiertes Syn, was die pathologische Rolle eines Überschusses des wt-Proteins bestätigt. Interessanterweise könnte die selektive Anfälligkeit dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra gegenüber den Neuronen des ventralen Tegmentalbereichs mit den erhöhten Syn-Spiegeln in diesen Neuronen bei alten Affen und Menschen korrelieren28.

Axonale Verletzungen, eine zugrunde liegende Ursache neurodegenerativer Erkrankungen, lösen Veränderungen in der Genexpression, Proteinkomplexen und der Neulokalisierung von Proteinen aus. Die Syn-Anreicherung in beschädigten Axonen29 deutet auf eine mögliche Rolle bei der regenerativen Keimung und der Wegfindung von Wachstumskegeln hin. Die Aktindynamik ist für die Axonführung notwendig und ungesteuertes Axonwachstum findet ohne Aktinassemblierung statt30. Eine regionale Störung des Aktins führt dazu, dass sich der Wachstumskegel von dieser Region abwendet und in die Richtung wächst, in der sich stabilisierte Filopodien befinden31.

Wir berichten, dass eine chronische Exposition gegenüber extrazellulärem Syns die axonale Verlängerung sowohl während des physiologischen Wachstums als auch während des erneuten Wachstums nach einer Läsion verlangsamt. Wir fanden heraus, dass die Geschwindigkeit von Aktinwellen, die als Parameter der Neuritendynamik32 verwendet wird, mit der Axonverlängerung korreliert und in Gegenwart von Syns verringert ist. Es wurde gezeigt, dass Aktinwellen Aktin und Cofilin 1 enthalten, während die Syns-Behandlung eine Akkumulation von phosphoryliertem Cofilin 1 in Aktinwellen induzierte. Konsequenterweise wurde die Geschwindigkeit der Aktinwellen in Gegenwart des Aktin-depolymerisierenden Arzneimittels LatA erhöht und in Gegenwart des Aktin-stabilisierenden Arzneimittels Jaspla verringert. Nach einer axonalen Verletzung waren die Mikrofilamente teilweise unterbrochen, wie in unseren vorherigen Ergebnissen gezeigt wurde, und eine Verschiebung der Aktindynamik in Richtung Polymerisation begünstigte die Heilung der Läsion. Tatsächlich war die Geschwindigkeit der Aktinwellen in Gegenwart von Syns höher als vor der Läsion. Zu späteren Zeitpunkten wurde die Regeneration des Axons jedoch durch den verringerten Aktinumsatz aufgrund der Syn-Präsenz behindert. Die Korrelation zwischen der Cofilin-1-Aktivität und der Geschwindigkeit der Aktinwellen wurde mithilfe von LatA bewertet. In einem durch LatA induzierten Zustand der Mikrofilament-Depolymerisation, ähnlich der Situation im verletzten Axon, erhöhte sich die Geschwindigkeit der Aktinwellen und Cofilin 1 wurde als Rückkopplungsmechanismus inaktiviert. Nach dem Auswaschen von LatA wurde Cofilin 1 dephosphoryliert, um den Zustand zu kontrollieren und seine Aktivität wiederherzustellen, um die Aktindynamik auszugleichen, während Cofilin 1 in Gegenwart von Syns chronisch inaktiv blieb.

Cofilin 1, ein Aktin-trennendes Protein, erhält den Pool an Aktin-Monomeren aufrecht und gestaltet so Aktinfilamente um, indem es die Auf- und Abbaudynamik verbessert33. Die Phosphorylierung von Cofilin 1 an einem konservierten Serin3-Rest durch mehrere Kinasen, einschließlich LIMK, führt zur Hemmung seiner Aktin-Depolymerisierungsaktivität34,35. Die Aktivität von Cofilin 1 ist an der Axonverlängerung und der Beweglichkeit der Wachstumskegel beteiligt36,37,38 und in retinalen Neuronen fungiert Cofilin 1 als Ziel des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF) bei der Modulation der Filopodiendynamik39,40.

Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass Cofilin als Reaktion auf knochenmorphogene Proteine in spinalen Neuronen von Xenopus laevis eine Rolle bei der Führung von Wachstumskegeln spielt.41 Es wurde gezeigt, dass der Nervenwachstumsfaktor (NGF) und Netrin-1 das Vorstehen der Plasmamembran im Wachstumskegel stimulieren und gleichzeitig das aktive Cofilin erhöhen . Lokale Erhöhungen des aktiven Cofilins führten zu einer attraktiven Drehung und eine verringerte Cofilin-Aktivität schwächte die Drehung zu NGF oder Netrin-142 ab.

Wir haben zuvor gezeigt, dass Syns die Inaktivierung von Cofilin 1 über den Rac1/LIMK-Weg induzierte, ausgelöst durch die Akkumulation von Glucose-verwandtem Protein von 78 kDa (GRP78) an der äußeren Oberfläche der Plasmamembran. Hier liefern wir Beweise dafür, dass Syn, das zwei Tage lang im neuronalen Medium vorhanden war, eine chronische Phosphorylierung von Cofilin 1 aufrechterhielt und dass in diesen Neuronen die Reaktion des Wachstumskegels auf Lockstoffe verloren ging. Tatsächlich konnte die Expression von aktivem Cofilin 1 in Neuronen die attraktive Drehung des Wachstumskegels wiederherstellen. Konsequenterweise verhinderte die Expression von aktivem Cofilin 1 auch die durch Syns induzierten Defizite in der Axonverlängerung und in der Bewegungsgeschwindigkeit von Aktinwellen, was darauf hindeutet, dass Cofilin 1 ein Hauptziel der pathologischen Aktivität von Syns während der Entwicklung neugeborener Neuronen und der Regeneration von verletzten Neuronen ist. Erhöhter Zelltod und verringertes Überleben neugeborener Neuronen bei Syn-transgenen Tieren können auf Defekte beim Auswachsen und bei der synaptischen Integration zurückzuführen sein, und es wurde gezeigt, dass eine zunehmende Menge an Syn toxisch ist, um diese pathologischen Wirkungen auszuüben12.

Darüber hinaus verstärkt der Zusammenhang zwischen Cofilin-1-Aktivität und Neurotrophinen, von denen auch gezeigt wurde, dass sie die Anzahl und Bewegungsgeschwindigkeit von Aktinwellen wiederherstellen25, die Verwendung von Neurotrophinen als therapeutisches Ziel bei der Behandlung von PD und verwandten Synukleopathien.

Alle chemischen Reagenzien wurden von Sigma Aldrich (St. Louis, MO) und GE Healthcare (Uppsala, Schweden) gekauft. Petrischalen mit Glasboden stammten von Mattek Corp (Ashland, MA) und Dunns Kammer stammte von Hawksley (Lancing, UK).

Monoklonale Maus-Antikörper: Anti-Aktin (Sigma Aldrich); Anti-Cofilin 1 (Abcam, Cambridge, MA). Polyklonale Kaninchen-Antikörper: antiphosphoryliertes Cofilin 1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); Anti-β-Tubulin III (Covance, Emervylle, CA).

Fluoreszenzkonjugierte Alexa Fluor-Sekundärantikörper stammten von Molecular Probes (Eugene, OR); Meerrettich-Peroxidase-konjugierte Sekundärantikörper (Bio-Rad, Hercules, CA); FITC-konjugiertes Phalloidin (Molecular Probes-Life Technologies, Carlsbad, CA).

DNAs von pmRFP-N1-Human-Cofilin wt (Katalognummer 50856), pmRFP-N1-Human-Cofilin S3A (Katalognummer 50857) und pmRFP-N1-Human-Cofilin S3E (Katalognummer 50858) (Addgene (Cambridge, MA) waren ein Geschenk von James Bamburg .

Konstrukte, die das in das pET21d-Plasmid eingefügte humane wt- oder A30P-Syn in voller Länge kodieren, waren ein freundliches Geschenk von Dr. Brett Lauring (Columbia University, New York, NY, USA). Bakterien wurden während der exponentiellen Phase mit 1 mM Isopropyl-D-1-thiogalactopyranosid für 2 Stunden induziert und durch Zentrifugation geerntet. Das Pellet wurde in Puffer A (HEPES/KOH 20 mM, pH 7,2 und KCl 100 mM) solubilisiert und 5 Minuten lang auf 90 °C erhitzt. Das Zelllysat wurde 30 Minuten lang bei 72.000 × g zentrifugiert und der Überstand auf eine HiTrap-monoQ-Syn-Säule geladen und mit einem KCl-Linergradienten von 100 bis 500 mM eluiert. Die interessierenden Fraktionen wurden zuvor unter Verwendung eines Centricon-Zentrifugalfilters konzentriert Laden auf eine Superose-12-Säule in Puffer A. Die Syn-haltigen Fraktionen wurden gepoolt, konzentriert und bei –80 °C gelagert. Um die Syn-Reinheit zu kontrollieren, wurde 1 mg gereinigtes Syn auf eine Superdex 75 10/300-Säule (GE Healthcare) geladen und mit 0,5 ml/min auf einem AKTA Purifier-Gerät eluiert. Die optische Dichte (OD) wurde kontinuierlich bei 280 nm gemessen und 50 ng gereinigtes Syn wurden auf ein SDS-PAGE-Gel geladen und mit Coomassie Brilliant Blue angefärbt.

Primäre neuronale Kulturen wurden aus Hippocampi gewonnen, die von C57BL/6S E 18-Mäusen (Harlan, Udine, Italien) präpariert worden waren. Die Tiere wurden in einer pathogenfreien Tierhaltung gehalten. Alle Experimente wurden in strikter Übereinstimmung mit den vom italienischen Gesundheitsministerium genehmigten experimentellen Verfahren durchgeführt.

Die Embryonen wurden entnommen und unter sterilen Bedingungen präpariert. Hippocampi wurden durch enzymatischen Verdau in Trypsin (0,125 % für 30 Minuten bei 37 °C) dissoziiert. Die Trypsinaktivität wurde durch Zugabe von Komplettmedium (NeurobasalTM (Gibco), ergänzt durch B27 (2 %, Gibco), Alanylglutamin (2 mM, Gibco), Penicillin/Streptomycin (beide 1 mM, Sigma), das 10 % fötales Rinderserum enthielt, blockiert. FBS, Gibco). Nach der Trypsinisierung wurden die Gewebe in vollständigem Medium ohne FBS gespült und mit einer Plastikpipette dissoziiert. Neuronen wurden zur Langzeitbildgebung entweder auf Petrischalen mit Glasboden ausplattiert (Dichte von 20.000 Neuronen auf einem Glasboden mit 10 mm Durchmesser). ; oder auf Glasdeckgläsern für die Immunzytochemie (Dichte von 30.000 Neuronen auf Deckgläsern mit 18 mm Durchmesser); oder auf Glasdeckgläsern (Quadrat #3D) für Chemotaxie-Assays (Dichte von 50.000 Neuronen auf 20 × 26 mm Deckgläsern) oder auf Petri-Mehrfachvertiefungen aus Kunststoff Schalen für Immunblot (Dichte von 350.000 Neuronen auf einer Schale mit 30 mm Durchmesser). Zwei Stunden nach dem Ausplattieren wurden 2 ml serumfreies Glia-konditioniertes Medium hinzugefügt.

Kortizes wurden von E18-Mäusen präpariert und in kaltes HBSS gelegt und dann in Trypsin 0,125 % + 1 mg/ml DNAse für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, der Überstand wurde gelagert und die Inkubation in Trypsin wiederholt. Zwei Überstände wurden gepoolt und 5 Minuten lang bei 1500 U/min und 8 °C zentrifugiert. Die Zellen wurden in MEM + 10 % Pferdeserum, Pen/Strep, 33 mM Glucose und 2 mM Glutamin resuspendiert. Gliazellen wurden auf T75-Kolben ausplattiert, die mit 0,01 mg/ml Poly-D-Lysin beschichtet waren. Als 100 % Konfluenz erreicht war, wurde das MEM-Medium durch Neurobasal-Komplettmedium ersetzt. Nach 2 Tagen wurde das Glia-konditionierte Medium zu Hippocampus-Neuronen gegeben.

Primäre Hippocampus-Neuronen wurden unmittelbar nach der Dissoziation in Suspension elektroporiert, wobei das Basic Nucleofector Kit für primäre Neuronen im O-05-Programm (Amaxa Biosystems, Köln, Deutschland) verwendet wurde. Neuronen wurden mit den Konstrukten von Interesse (800 ng pmRFP-N1 humanes Cofilin wt, 400 ng pmRFP-N1 humanes Cofilin S3A, 400 ng pmRFP-N1 humanes Cofilin S3E/1.000.000 Neuronen) an der 4D-NucleofectorTM Core Unit (Amaxa) elektroporiert plattiert auf Glasdeckgläsern oder auf Kunststoff-Petrischalen, wie oben beschrieben. Elektroporierte Neuronen wurden bei 3 DIV verwendet.

DIV-Neuronen wurden mit eiskaltem HBSS auf Eis gewaschen und in Lysepuffer (100 μl 1 % SDS) gekratzt. Die Proben wurden 2 Minuten lang bei 100 °C gekocht, 5 Sekunden lang beschallt und 15 Minuten lang bei 12.000 U/min zentrifugiert. Zu jeder Proteinprobe wurde 5× Probenpuffer (250 mM TrisHCl pH 6,8, 10 % SDS, 30 % Glycerol 30, 5 % β-Mercapitalethanol, 0,02 % Bromphenolblau) hinzugefügt. Die Proteine wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Immunblotting aufgetrennt.

Hippocampus-Neuronen wurden ausplattiert und 2 Tage lang mit wt oder A30P Syn behandelt; Kontrollinkubationen wurden durch Zugabe des chromatographischen Elutionspuffers erhalten. Neuronen wurden mit 4 % PFA fixiert und 1 Stunde lang mit FITC-konjugiertem Phalloidin gefärbt. Mit 2 μM LatA (Molecular Probes-Life Technologies) behandelte Neuronen wurden 20 Minuten und 2 Stunden nach dem Auswaschen von Lat A fixiert. Mit 12 nM Jaspla (Molecular Probes-Life Technologies) behandelte Neuronen wurden nach 20 Minuten fixiert. Konfokale Bilder wurden in einem konfokalen Leica SP2-Mikroskop unter Verwendung eines Leica 63×-Objektivs (NA 1,4; Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) aufgenommen. Alle Bilder wurden mit ImageJ (NIH, Bethesda, MD) analysiert.

Langfristige Hellfeld-Zeitrafferexperimente (bis zu 16 Stunden) wurden mit einem kommerziellen Umkehrmikroskop (Eclipse Ti E; Nikon Instruments Inc.) mit laserbasiertem Autofokus und motorisiertem Tisch für die sequentielle Mehrpunktbildaufnahme durchgeführt. Das Mikroskop war mit einer ladungsgekoppelten Kamera (CCD) (Andor DU-897D-C00), Plan Fluor 40×, 0,75 NA DIC-Objektiv und Bildgebungssoftware (Nis elements AR; Nikon Instruments Inc.) ausgestattet. Es wurden etwa 10 Neuronen abgebildet Für jede Bedingung wurden Bilder mit einem Bildintervall von 2 Minuten aufgenommen.

Für die Langzeit-Zeitrafferbildgebung wurden Neuronen in einem speziell angefertigten Zellinkubatortisch, der für ein inverses Mikroskop adaptierbar war, auf einer stabilen Temperatur von 35 °C gehalten43. Um den physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten, wurde ein mit Luft ausgeglichenes Gas mit 5 % CO2 mit einem Durchflussmesser (CO2BX, Okolab) gemischt und in den Probenhalter geleitet. Darüber hinaus wurde auf dem Kulturmedium ein Ölfilm (Polydimethylsiloxan 200 Fluid, 0,913 g/ml, Sigma Aldrich) abgeschieden, der für CO2, aber nicht für Wasser durchlässig ist. Bilder von Neuronen wurden durch Mehrpunkterfassung ausgewählt und im Abstand von 1 oder 2 Minuten pro Bild abgebildet.

Die Laserdissektionsquelle war ein gepulster Sub-Nanosekunden-UV-Nd:YAG-Laser bei 355 nm (PNV001525-040, PowerChipnano-Pulse UV-Laser, Teem Photonics, Meylan, Frankreich). Die Schädigung des Axons schien sich auf die Bildung eines Halses zu beschränken, wenn die Pulsenergie auf 1,8 μW reduziert wurde. In der Mitte des Axons wurde eine Ablation vorgenommen44.

Die Dunn-Kammern wurden mit Neurobasal und dann zweimal mit Glia-konditioniertem Medium vorgewaschen. Zum Füllen der inneren und äußeren Vertiefungen wurden konditionierte Medien hinzugefügt. Das Deckglas mit den Neuronen wurde umgedreht über die Dunn-Kammer gelegt und ließ am Rand einen schmalen Schlitz zum Entleeren und Wiederauffüllen der äußeren Vertiefung zurück. Überschüssiges Medium wurde durch Abtupfen mit Filterpapier entfernt und drei Seiten der Dunn-Kammer wurden mit heißem Paraffin:Vaseline (1:1) versiegelt. Mit einer Gelladespitze wurde die gesamte Flüssigkeit aus der äußeren Vertiefung durch den Füllschlitz entfernt und 40 μM 8-br-cAMP (BioLog Life Science Institute, Bremen, Deutschland), verdünnt in konditioniertem Medium, in die äußere Vertiefung gegeben. Anschließend wurde der Einfüllschlitz mit heißem Paraffin/Vaseline verschlossen. Dunns Kammer wurde schnell zusammengebaut, um Änderungen im pH-Wert des Mediums zu vermeiden. Nach dem Zusammenbau der Dunn-Kammer wurde sofort mit der Bildgebung begonnen. Mit einem 20-fach-Objektiv wurden 30 Minuten lang jede Minute Zeitraffer-Phasenkontrastbilder aufgenommen. Für jede Dunn-Kammer wurden etwa 15 Bühnenpositionen an verschiedenen Stellen rund um die Ringbrücke abgebildet. Anschließend wurde der Prozentsatz der Neuronen berechnet, die sich dem Gradienten zuwandten.

Hippocampus-Neuronen, die auf Petrischalen mit Glasboden, die mit 2 ml serumfreiem Glia-konditioniertem Medium gefüllt waren, plattiert waren, wurden bei DIV 1 mit dem pLenti4-Actin-YFP-Virus infiziert. Neuronen wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 5 μM wt oder A30P Syn 2 Tage lang inkubiert . Experimente wurden mit Neuronen bei 3 DIV durchgeführt. FRAP-Experimente wurden mit einem Leica TCS SP5-Mikroskop unter Verwendung eines 63-fachen Ölobjektivs (Leica Microsystems) durchgeführt. Die Region of Interest (ROI) wurde ausgewählt und das Emissionssignal mit einem 488-nm-Laser bei 20 % der Intensität als Signal vor dem Bleichen erfasst. Anschließend wurde der ROI mit drei Lasern bei 458 nm, 476 nm und 488 nm, alle auf 100 % Intensität eingestellt, photogebleicht. Die Aufnahme nach dem Bleichen wurde 60 Bilder lang mit einer Rate von 1 Bild/0,6 s durchgeführt. Die Intensität des ROI für jedes Bild wurde auf die durchschnittliche Anfangsintensität der Bilder vor dem Bleichen und auf die Fläche des gebleichten Axons normiert. Die Wiederherstellung der Fluoreszenz wurde um das unerwünschte Photobleichen korrigiert, das während der Live-Bildgebung in einem Kontrollbereich im Sichtfeld quantifiziert wurde. Die Intensität der Fluoreszenz (F) zu jedem Zeitpunkt wurde automatisch von der Leica Analyzing Software generiert. Die in den ersten 5 Bildern berechnete durchschnittliche Intensität entspricht dem Wert vor dem Bleichen (Fpre), die durchschnittliche Intensität des 8. Bildes ist der Intensitätswert (F0) nach der Photobleichphase im 6. und 7. Bild.

Einzelne Diagramme jedes Experiments wurden an eine Modellfunktion angepasst. Die Fluoreszenzwiederherstellung von Aktin-YFP wurde am besten durch eine einfache Exponentialfunktion angepasst (eine doppelte Exponentialfunktion verbessert die Qualität der Anpassung nicht wesentlich), was das Vorhandensein mobiler Aktinfraktionen mit unterschiedlichen Wiederherstellungskinetiken offenbarte. Dabei kam folgendes Modell zur Anwendung:

- A ist der Prozentsatz der mobilen Aktinfraktion.

- B ist die Zeitkonstante der Fluoreszenzerholung.

A und B wurden aus der Anpassung jeder Kurve erhalten. Der Mittelwert ± SEM wurde für den Prozentsatz der Fluoreszenzwiederherstellung und für die Zeitkonstante der Fluoreszenzwiederherstellung für jede Bedingung berechnet.

Das letzte Diagramm zeigt den normalisierten Fluoreszenzintensitätswert von (F − F0)/Fpre auf der Y-Achse und die Zeit (s) auf der X-Achse. Die Anpassung der Kurve erfolgte in Matlab. Die statistische Analyse wurde mit der GraphPad-Software durchgeführt.

Die Bildkomposition und das Zeichnen erfolgten mit Adobe Photoshop (Adobe System, San Jose, CA). Die Daten wurden mit der GraphPad Prism-Software (Graph Pad, La Jolla, CA) analysiert und als Mittelwerte ± Standardfehler (SEM) ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde durch eine einfache ANOVA und anschließend den Dunnett-Test für mehrere Vergleiche bestimmt (P-Werte < 0,05 wurden als signifikant angesehen).

Zitierweise für diesen Artikel: Tilve, S. et al. Die Aktivierung von Cofilin 1 verhindert die durch extrazelluläres Alpha-Synuclein verursachten Defekte in der Axonverlängerung und -führung. Wissenschaft. Rep. 5, 16524; doi: 10.1038/srep16524 (2015).

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Referenzen herunterladen

Wir danken Brett Lauring (Columbia University, NY, NY) für Syn-Plasmide. Wir danken auch M. Pesce für die technische Unterstützung bei Mikroskopieexperimenten. Diese Arbeit wurde von der Telethon Foundation GGP10109 (an EC) unterstützt.

Abteilung für Neurowissenschaften und Gehirntechnologien, Italienisches Institut für Technologie, Genua, 16163, Italien

Sharada Tilve, Francesco Difato und Evelina Chieregatti

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ST, FD und EC konzipierten und gestalteten die Experimente; ST führte die Experimente durch und analysierte die Daten; EC hat das Papier geschrieben.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Tilve, S., Difato, F. & Chieregatti, E. Die Aktivierung von Cofilin 1 verhindert die durch extrazelluläres Alpha-Synuclein verursachten Defekte in der Axonverlängerung und -führung. Sci Rep 5, 16524 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16524

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Eingegangen: 17. August 2015

Angenommen: 15. Oktober 2015

Veröffentlicht: 12. November 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16524

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