Steuerung der Anammox-Speziation und Biofilm-Anlagerungsstrategie mit N

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21720 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die herkömmliche Stickstoffentfernung in der Abwasserbehandlung erfordert einen hohen Sauerstoff- und Energieeintrag. Die anaerobe Ammoniumoxidation (Anammox), die einstufige Umwandlung von Ammonium und Nitrit in Stickstoffgas, ist eine energie- und kosteneffizientere Alternative, die in großem Umfang bei der Nebenabwasserbehandlung eingesetzt wird. Es wäre auch eine gängige Behandlungsoption, wenn die Artenvielfalt und Physiologie besser verstanden würden. Anammox-Bakterien wurden aus einem einzigen Inokulum unter Standardanreicherungsbedingungen mit schrittweiser Erhöhung der Nitrit- und Ammoniakkonzentration (R1), Stickstoffmonoxidergänzung (R2) oder komplexem organischem Kohlenstoff auf eine relative Häufigkeit von bis zu 80 %, 90 % und 50 % angereichert aus Hauptabwasser (R3). Candidatus Brocadia caroliniensis war in allen Reaktoren vorherrschend, es kam jedoch zu einer Verschiebung hin zu Ca. Brocadia sinica trat bei Ammonium- und Nitritkonzentrationen > 270 mg NH4-NL-1 bzw. 340 mg NO2-NL-1 auf. Wenn NO vorhanden war, wurde das heterotrophe Wachstum gehemmt und Ca. Jettenia existierte neben Ca. B. caroliniensis, bevor es abnahm, als der Nitritgehalt auf 160 mg NO2–NL−1 anstieg. Die Ergänzung mit organischem Kohlenstoff führte zur Entstehung heterotropher Gemeinschaften, die sich gemeinsam mit Ca entwickelten. B. caroliniensis. Ca. B. caroliniensis und Ca. Jettenia bildete bevorzugt Biofilme auf Oberflächen, während Ca. Brocadia sinica bildete in Suspension Körnchen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass mehrere Anammox-Bakterienarten nebeneinander existieren und Unternischen in Anammox-Reaktoren besetzen und dass die dominante Population beispielsweise durch eine Änderung der Stickstoffbelastung reversibel verschoben werden kann (dh eine hohe Nitritkonzentration begünstigt Ca. Brocadia caroliniensis). Die Speziation hat Auswirkungen auf die Gestaltung von Abwasserprozessen, wobei die optimale Zellimmobilisierungsstrategie (z. B. Träger vs. Granulat) davon abhängt, welche Spezies dominiert.

Die anaerobe Ammoniumoxidation (Anammox) in Kombination mit partieller Nitritierung wird häufig zur Behandlung stickstoffreicher und kohlenstoffarmer Abwässer eingesetzt (z. B. Nebenstrombehandlung), da im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren erhebliche Energieeinsparungen erzielt werden. Es wurde auch als nachhaltige Behandlungsoption für die Behandlung kommunaler Abwässer (d. h. allgemeine Behandlung) vorgeschlagen. Neunzehn Candidatus-Anammox-Bakterienarten wurden in verschiedenen Umgebungen identifiziert, darunter suboxische Meereszonen, Küstensedimente, Seen und Kläranlagen. Diese wurden in fünf Candidatus-Gattungen eingeteilt1,2,3 und während Anammox-Bakterien verschiedene natürliche und technische Systeme besiedeln können, koexistieren verschiedene Gattungen selten im selben Lebensraum4. Es wird angenommen, dass Unterschiede in den Wachstumsraten, Substrataffinitäten, Empfindlichkeiten gegenüber hemmenden Verbindungen, bevorzugten Wachstumssubstraten und unterschiedlichen Stoffwechselwegen zur Nischenspezialisierung beitragen1,5,6,7,8,9,10.

In Anammox-Reaktoren im Labormaßstab wurde unter verschiedenen Bedingungen über Populationsverschiebungen auf Arten- und Gattungsebene berichtet9,10,11. Während des Scale-Ups des ersten großmaßstäblichen kommerziellen Anammox-Reaktors verlagerte sich die dominierende Population von Ca. Kunenia stuttgartiensis bis ca. Brocadia anammoxidans, obwohl keine Gründe dafür angegeben wurden12. Studien haben gezeigt, dass bestimmte Umgebungsbedingungen in Reaktoren mit partieller Nitrierung/Anammox (PN/A) nur für einzelne Anammox-Bakterienarten selektieren können11,13. Zum Beispiel, Ca. Jettenia moscovienalis2, Ca. B. caroliniensis14 und Ca. B. sinica13 wurde in verschiedenen Seitenstromreaktoren zur Behandlung von anaerober Faulflüssigkeit nachgewiesen, während Ca. Brocadia. sp. 40 wurde unter normalen Bedingungen als das dominierende Anammox-Bakterium identifiziert15. Park et al.11 zeigten, dass die Futterzusammensetzung bei der Auswahl der Anammox-Bakterien wichtiger ist als das Inokulum und die Reaktorkonfiguration. Dennoch besteht kein offensichtlicher Konsens darüber, welche Faktoren eine Anammox-Bakterienart einer anderen vorziehen.

Die Aufklärung von Faktoren, die bestimmte Anammox-Bakterienarten mit spezifischen kinetischen und physiologischen Eigenschaften anreichern, würde möglicherweise das Prozessdesign und die Leistung verbessern. Anammox-Bakterien kommen unter einer Reihe von Bedingungen vor, beispielsweise in Nebenstrom- und Hauptstrom-PN/A-Systemen mit hohen bzw. niedrigen Ammonium-/Nitritkonzentrationen, und viele Faktoren spielen wahrscheinlich bei der Artenauswahl eine Rolle. Während Nitrit (NO2−) für Bakterien toxisch ist, kann es auch als Elektronenakzeptor für die Ammoniumoxidation und Elektronendonor für die Reduktion von Bicarbonat zu Biomasse fungieren. Es übt somit einen Anammox-Bakterien-Selektionsdruck auf der Grundlage ihrer Fähigkeit aus, es zu nutzen und zu tolerieren. Bei Anammox-Bakterien, die NO2-Konzentrationen zwischen 100 und 400 mg ausgesetzt waren, wurde eine Verringerung der Anammox-Aktivität um 50 % berichtet NL−116,17,18. Während Stickstoffmonoxid (NO), ein starkes Oxidationsmittel, das aus Nitrit als Zwischenprodukt im biochemischen Anammox-Stoffwechselweg entsteht19,20, toxisch ist, können Anammox-Bakterien es in höheren Konzentrationen tolerieren als viele andere Bakterien21,22. Zusätzlich zum potenziellen Selektionsdruck durch Nitrit und NO wurde festgestellt, dass die Fähigkeit, auch organische Substrate (z. B. Acetat und Propionat) zu verbrauchen, Ca Wettbewerbsvorteile verleiht. B. fulgida und Ca. Anammoxoglobus propionicus gegenüber anderen Arten, einschließlich Denitriferen6,7. Es bleibt abzuwarten, ob die Selektion solcher „fakultativen Chemoorganotrophen“ im komplexen organischen Kohlenstoffmilieu unter normalen Bedingungen begünstigt wäre. Dennoch besetzen die Anammox-Bakterien hochspezialisierte Nischen, die nicht nur durch die Konzentrationen von Ammonium und Nitrit definiert werden.

Die Fähigkeit, die Aktivität spezifischer Anammox-Bakterienarten mit günstigen physiologischen und Wachstumseigenschaften zu steigern, ist besonders vorteilhaft für den Start und die Optimierung industrieller Anammox-Prozesse. Während bewährte Nebenstrom-Anammox-Schlamm üblicherweise zum Animpfen oder zur biologischen Verstärkung neuer großtechnischer Anlagen verwendet werden, ist die Beimpfung bestehender volltechnischer Nicht-Anammox-Anlagen zur Inbetriebnahme von Anammox-Reaktoren logistisch anspruchsvoll11 und aufgrund der Empfindlichkeit des Prozesses zeitaufwändig auf Futtermittelzusammensetzung, Sauerstoff12 und konkurrierende mikrobielle Arten23. Aufgrund der langsamen Wachstumsraten der Anammox-Bakterien ist in Anammox-Reaktoren eine hohe Biomasseretention erforderlich. Dies kann durch die Förderung der Biomasseaggregation in Biofilm-basierten Anammox-Reaktoren24 erreicht werden. Biomasse in einem Anammox-Reaktor kann sich selbst zu suspendierten Flocken, festen Filmen auf Oberflächen oder Trägern, kleinen Körnern, großen Körnern oder einer Kombination all dieser Morphologien zusammenlagern25. Solche Aggregate können innerhalb des Reaktors funktional unterschiedliche Rollen spielen und sogar die Effizienz der Stickstoffentfernung beeinflussen26,27. Das Verständnis, welche Faktoren die Artenauswahl beeinflussen und ob verschiedene Arten bestimmte Biofilmmorphologien annehmen, könnte Prozessdesign und Kontrollstrategien beeinflussen, um eine stabilere Stickstoffentfernung unter dem breiten Spektrum von Betriebsbedingungen zu erreichen, die typischerweise in Anammox-Bioreaktoren anzutreffen sind28.

Diese Arbeit zielt darauf ab, zu untersuchen, wie die Zusammensetzung der Anammox-Gemeinschaft, die Prozessleistung und die Biofilmmorphologie durch Faktoren verändert werden, die typischerweise in industriellen Anammox-Systemen anzutreffen sind (z. B. Mainstream im Vergleich zu Sidestream). Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass unterschiedliche Substratzusammensetzungen (a) Abwässer mit organischem Kohlenstoffmangel und N-Belastungen für häusliche Haupt- und Nebenabwässer (Reaktoren R1) simulieren und (b) einen oxidativen Stress simulieren, der typischerweise in PN/A-Systemen durch die Exposition auftritt NO (Reaktor R2) oder (c) häusliches Hauptabwasser mit hohem CSB:N (Reaktor R3) könnten für bestimmte Gemeinschaften, insbesondere Anammox-Bakterienarten, selektieren. Während einige dieser Faktoren zuvor unabhängig voneinander untersucht wurden17,29, untersucht diese Studie diese Faktoren bei der Auswahl von Anammox-Bakterienarten aus demselben Inokulum. Weitere Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie die relative Häufigkeit von Anammox-Arten manipuliert werden kann, wird die Gestaltung des Stickstoffentfernungsprozesses beeinflussen und möglicherweise zum Verständnis der Nischenaufteilung in komplexen mikrobiellen/Umweltlebensräumen beitragen.

Anammox-Bakterien wurden unter allen getesteten Anreicherungsbedingungen erfolgreich angereichert, wenn auch mit unterschiedlichen Startzeiten. Die Startphase war bei mit NO ergänztem R2 am kürzesten und die Anammox-Aktivität wurde innerhalb von 20 Tagen nach der Inokulation beobachtet, verglichen mit 39 Tagen bei R1, das unter Standardanreicherungsbedingungen betrieben wurde (Abb. 1A, B). In Gegenwart von komplexem organischem Kohlenstoff in R3 wurde die Anammox-Aktivität erst nach 50 Betriebstagen nachgewiesen (Abb. 1C). Sowohl in R1 als auch in R2 wurden die Ammonium- und Nitritkonzentrationen auf 280 mg NL-1 bzw. 350 mg NL-1 erhöht (Abb. 1A,B), oberhalb dessen die Anammox-Aktivität gehemmt wurde. Zusätzlich zur kürzeren Anlaufphase wurde für R2 eine kürzere hydraulische Retentionszeit (HRT) als für R1 angewendet, da die N-Entfernungsraten von 1200 mg NL-1 Tag-1 im Vergleich zu 800 mg NL-1 Tag-1 höher waren stabiler Betrieb (Abb. 1A,B). Trotz der höheren Beladungsrate waren die Schwebstoffkonzentrationen in beiden Reaktoren vergleichbar, was auf eine höhere spezifische N-Entfernungsaktivität für R2 als für R1 hinweist. In R3 wurde eine deutlich geringere N-Beladungsrate von 121 ± 6 mg NL−1 Tag−1 erreicht. Die endgültige Ammoniumkonzentration im Abfluss sank vom 58. bis zum 80. Tag stetig, wobei der Reaktor fortan eine stabile Ammoniumentfernungsaktivität durch Anammox-Bakterien zeigte. Auch der Restnitrit im Abwasser nahm vom 60. bis zum 100. Tag allmählich ab, zusammen mit einer Abnahme der Ammoniumkonzentration (Abb. 1C). Der durchschnittliche Gesamtbedarf an chemischem Sauerstoff (TCOD) und der Bedarf an löslichem chemischem Sauerstoff (sCOD) im Abwasser betrugen 87 ± 9 mg L-1 bzw. 51 ± 8 mg L-1, mit einer durchschnittlichen Entfernungsrate von 520 mg L-1 Tag −1 ab Tag 300.

Inbetriebnahme und Anreicherung von Anammox-Bakterien aus Belebtschlamm, der mit (A) synthetischem Abwasser mit Ammonium und Nitrit in R1, (B) synthetischem Abwasser mit Ammonium, Nitrit und kontinuierlicher Zufuhr von Stickoxid in R2 und (C) Primärwasser gefüttert wird Abwasser mit Nitrit in R3 angereichert. MLVSS (), Zuflussnitrit (NO2, ) und Stickstoffbeladungsraten (NLR, ) jeder Anreicherungsbedingung werden im oberen Bereich jedes Diagramms angezeigt; mit relativer Häufigkeit dominanter Anammox-Bakterien-OTUs, die mit Ca verbunden sind. B. caroliniensis () und Ca. B. sinica () und korrelierte Nicht-Anammox-Bakterien-OTUs, die mit Anaerolineaceae () und Fimbriimonadia () verbunden sind, sind in den unteren Feldern von (A, B) dargestellt; Ca. Jettenia () wurde auch in R2 (B) nachgewiesen. Ca. B. caroliniensis, das einzige dominante Anammox-Bakterium in R3, ist in (C) zusammen mit korrelierten Nicht-Anammox-Bakterien-OTUs, die mit Comamonadaceae () und Ca verbunden sind, dargestellt. Aquirestis () dominiert in einem anderen Stadium. Die relative Häufigkeit der gesamten Anammox-Bakterien wird in jedem Diagramm als Flächendiagramm () hervorgehoben. Die rot gestrichelten Linien markieren die Zeitpunkte, zu denen der Anammox-Biofilm von der Reaktorwand abgekratzt und in Suspension gebracht wurde. Die detaillierte chemische und mikrobielle Gemeinschaft (mit OTUs > 5 % zu jedem analysierten Zeitpunkt) ist in der ergänzenden Abbildung S1, Hintergrundinformationen, zu finden.

Die mikrobiellen Gemeinschaften von drei Reaktoren wurden nach Betriebstag (R = 0,53, p = 0,007) und durch die Verwendung verschiedener Reaktoren, dh R1 vs. R2 vs. R3 (R = 0,38, p = 0,001), unterschieden. Darüber hinaus zeigten die R1- und R2-Gemeinschaften auf verschiedenen Ebenen von N eine relativ starke Unähnlichkeit (R = 0,48 bzw. 0,57, mit p = 0,001 für beide). Zusammen mit der Zunahme der Anammox-Aktivität wurde in R1 und R2 eine Verschiebung der funktionellen Anammox-Bakterien zusammen mit zunehmender N-Belastung beobachtet, nicht jedoch in R3, wo eine niedrige N-Belastung aufrechterhalten wurde. Die 16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung zeigte, dass Anammox-Bakterien zu Beginn des Reaktorbetriebs in allen drei Reaktoren unter der Nachweisgrenze (< 0,018 %) lagen. In R1 und R2 stiegen die mit Anammox-Bakterien annotierten operativen taxonomischen Einheiten (OTUs) schrittweise auf 80 % (Tag 110) bzw. 90 % (Tag 95) der relativen Häufigkeit von OTUs bei einer Nitritkonzentration im Zufluss > 200 mg N L- 1 (Abb. 1A,B). Die mikrobiellen Gemeinschaften von R1 und R2 zeigten bei unterschiedlichen N-Gehalten eine relativ starke Unähnlichkeit (R = 0,48 bzw. 0,57, mit p = 0,001 für beide). Die mikrobielle Gemeinschaft war bei hoher N-Belastung hingegen nicht hoch differenziert (R = 0,29, p = 0,003). Trotz der Zunahme der relativen Häufigkeit mehrerer OTUs, die sowohl in R1 als auch in R2 mit Anammox-Bakterien verbunden sind, wurde eine einzelne OTU mit Ca. Brocadia, identifiziert als Ca. B. caroliniensis dominierte laut Klonbibliotheksanalyse (Abb. 2) während der ersten 120 Tage des Reaktorbetriebs. Ca. B. caroliniensis stieg während der Anreicherung auf eine relative Häufigkeit von 50 % in R1 und R2 an. Allerdings kam es ab Tag 100 zu einem weiteren Anstieg der Ammonium- und Nitritkonzentrationen im Zufluss über 220 mg NL-1 (N-Beladungsrate von 500 mg NL-1-Tag-1 für R1 und 750 mg NL-1-Tag-1 für R2). im allmählichen Anstieg von Ca. Brocadia_2, identifiziert als Ca. B. sinica durch Klonbibliotheksanalyse (Abb. 2).

Phylogenetischer Baum basierend auf 16S-rRNA-Sequenzen der wichtigsten OTUs (mit Postfix „*“) und Klonen (mit Postfix „**“) aus Amplikonsequenzierung bzw. Klonbibliotheksanalyse. Die Anzahl der identischen Kolonien pro gepflückter Gesamtzahl der Kolonien ist in Klammern angegeben, z. B. 34/40 bedeutet 34 identische Kolonien pro 40 gepflückten Kolonien. Der phylogenetische Baum wurde von ARB mit der SILVA-Datenbank erstellt. Aus der Klonbibliothek und der Amplikonsequenzierung erhaltene Sequenzen wurden mit dem Parsimony-Insertionstool von ARB in den Baum eingefügt. Die Sequenzen der nächsten Nachbarn wurden ausgewählt, um den endgültigen Baum mit der Neighbor-Joining-Methode mit Bootstrap von 1000 Replikationen zu generieren. Die gestrichelte Linie zeigt die Teilung der Familie Ca. Brocadiaceae und Gattung Ca. Brocadia. Als Außengruppe wurde Methanosaeta Concilii ausgewählt. Es wurden nur die nächstgelegenen identifizierten Sequenzen zur Anzeige ausgewählt. Die Skala zeigt 0,1 Nukleotidveränderung pro Nukleotidposition an. Die Sequenzzugehörigkeit und die relative Häufigkeit der wichtigsten Anammox-Bakterien stimmten zwischen der Amplikonsequenzierung und der Analyse der Klonbibliothek überein.

Ein Rückgang von Ca. B. caroliniensis wurde ebenfalls beobachtet (Abb. 1A, B). Über 180 Tage Reaktorbetrieb hinaus, Ca. Die relative Häufigkeit von B. sinica stieg in R1 bzw. R2 auf 33 % bzw. 42 %, während Ca. Die relative Häufigkeit von B. caroliniensis verringerte sich in beiden Reaktoren auf weniger als 10 %. In Gegenwart von organischem Kohlenstoff beträgt Ca. B. caroliniensis war während des gesamten Anreicherungsprozesses in R3 das dominanteste Anammox-Taxon, das mit einer niedrigen N-Beladungsrate von 120 mg NL−1 Tag−1 durchgeführt wurde (Abb. 1C). Allerdings war die relative Häufigkeit der gesamten Anammox-Bakterien in R3 (~ 50 %) deutlich geringer als in R1 und R2 (~ 80 %), was auf ein wettbewerbsfähigeres Umfeld für Anammox-Bakterien in Gegenwart von organischem Kohlenstoff schließen lässt. Die Analyse der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) (Abb. 3D–F) an R1 (Tag 80) und R2 (Tag 675) zeigte weiter, dass Ca. B. sinica dominierte in diesen Reaktoren, während Ca. B. caroliniensis blieb als einziges Anammox-Bakterium in R3 (Tag 683) nachgewiesen. Die entworfenen artspezifischen FISH-Sonden dienten dazu, allmähliche Populationsverschiebungen während des Reaktorbetriebs als Reaktion auf Änderungen der Kontrollfaktoren zu beobachten.

Lichtmikroskopische Bilder suspendierter Biomasseproben zeigen eine körnige Struktur in R1 (A) und R2 (B) und eine Flockenstruktur in R3 (C). An zerkleinertem Granulat wurde eine FISH-Analyse durchgeführt, um die Dominanz von Ca zu bestätigen. B. sinica (cyan) in R1 (D) und R2 (E) und die Prävalenz von Ca. B. caroliniensis (Magenta) in R3 (F) am Ende der Phase III. Alle anderen Anammox-Bakterien sind blau. Die hier gezeigten FISH-Bilder sind Vertreter der Kultur. Die Maßstabsbalken (A), (B) und (C) zeigen 1 mm an, während (D), (E) und (F) 1 µm anzeigen.

Während andere OTUs der Gattung Ca. Es wurden auch Brocadia nachgewiesen, deren relative Häufigkeit weniger als 10 % betrug (ergänzende Abbildung S1). Das Vorhandensein dieser Ca. Brocadia OTUs ist wahrscheinlich auf verschiedene Ca-Stämme zurückzuführen. Brocadia- oder Sequenzierungsfehler, da nur geringe relative Häufigkeiten festgestellt wurden. Abgesehen von Ca. Brocadia, OTUs, die Ca angeschlossen sind. Jettenia entstand als Koexistenz mit Ca. B. caroliniensis nur in R2 (mit kontinuierlicher NO-Versorgung), was darauf hindeutet, dass die Anwesenheit von NO einen Wettbewerbsvorteil für Ca darstellen könnte. Jettenia. Allerdings ca. Jettenia nahm mit zunehmender N-Beladungsrate ab (dh nach Tag 102).

Ca. Jettenia wurde nur in R2 beobachtet, nicht jedoch in R1 und R3, was auf die Anwesenheit von NO zurückzuführen sein könnte. Während des Anreicherungsprozesses war jedoch unklar, ob der NO-Effekt auf die Einwirkung von oxidativem Stress zurückzuführen war oder darauf, dass es als Substrat für die Ammoniumoxidation verwendet wurde. Dies konnte nicht beurteilt werden, da bei der Anreicherung Nitrit im Überschuss vorlag. Um zu untersuchen, ob NO verbraucht wird, wurde Nitrit in R2 systematisch abgereichert (Phase II) und gleichzeitig die gleiche Menge NO dosiert (Phase I). Nach 76 Tagen Nitritmangel wurde in Phase III schrittweise wieder Nitrit eingeführt (Abb. 4).

Die Auswirkung von Nitritmangel (Phase II) und Nitritmangel (Phase III) auf die Veränderungen in der (A) Anammox-Bakteriengemeinschaft von OTUs, die mit Ca verbunden sind. B. caroliniensis () und Ca. B. sinica () und Ca. Jettenia () in suspendierter (auf der x-Achse als „Granulat in Suspension“ hervorgehobener) und anhaftender Wachstumsbiomasse (auf der x-Achse als „Biofilm an der Wand“ hervorgehoben) und die NO-Verbrauchsrate (NCR, ) von R2 , gespeist mit synthetischem Abwasser mit Ammonium, Nitrit und kontinuierlicher Zufuhr von Stickoxid. Der Nitritzufluss (NO2) wurde von normal (Phase I) auf Erschöpfung (Phase II) und Erschöpfung (Phase III) eingestellt. Die relative Häufigkeit der gesamten Anammox-Bakterien wird als Flächendiagramm hervorgehoben (). FISH-Bilder wurden mit Ca aufgenommen. B. sinica in Cyan und Ca. B. caroliniensis in Magenta während Phase I (B) und Phase III (C) aus zerkleinertem Granulat.

Die Verringerung der Nitritkonzentration führte zu einer Verringerung der relativen Ca-Häufigkeit. B. sinica in Suspension ging mit einem Anstieg der NO-Verbrauchsrate (NCR) einher, während für beide Ca ein leichter Anstieg beobachtet wurde. B. caroliniensis und Ca. Jettenia in Phase II (Abb. 4). Die Anwesenheit von Ca. B. caroliniensis, das in Phase I fehlte, wurde auch durch FISH-Analyse in Phase II nachgewiesen (Abb. 4). Während der Phase II durchgeführte Chargenaktivitätstests zeigten auch einen Rückgang der nitritabhängigen Ammoniumentfernungsrate von 1352 mg N g MLVSS−1 Tag−1 vor dem Nitritabbau (Phase I) auf 681 mg N g MLVSS−1 Tag−1 danach Nitritabbau (Phase II). Dennoch war die Gesamtaktivität in R2 immer noch höher als die in R1, selbst bei einer spezifischen nitritabhängigen Ammoniumentfernungsrate von 575 mg N g MLVSS−1 Tag−1 (Abb. 5). Im Normalbetrieb (Phase I) war die NO-abhängige Ammoniumoxidation in Abwesenheit von Nitrit in beiden Reaktoren unbedeutend, was die Hypothese weiter stützt, dass Nitrit anstelle von NO der bevorzugte Elektronenakzeptor ist und die Ammoniumentfernung durch Ca nicht erreicht werden kann. B. sinica über direkte Kopplung zur NO-Reduktion. Im Gegensatz dazu stiegen die Ammoniumoxidationsraten mit NO in Abwesenheit von Nitrit in R2 bei 440 mg N g MLVSS−1 Tag−1 nach Nitritabbau in Phase II um mehr als das Fünffache an, verglichen mit 33 und 80 mg N g MLVSS−1 Tag −1 in R1 bzw. R2 in Phase I im Normalbetrieb (Abb. 5). Dies legt die Auswahl von Anammox-Bakterienarten nahe, die in der Lage sind, von außen zugeführtes NO zur Oxidation von Ammonium zu nutzen.

Batch-Aktivitätsexperimente mit (i) NH4 + NO2, (ii) NH4 + NO2 + NO, (iii) NH4 + NO im Kontrollreaktor R1 und Versuchsreaktor R2 (a) vor Nitritbegrenzung (Phase I), (b) unter Nitrit Begrenzung (Phase II) und (c) nach Nitritauffüllung (Phase III).

Zu Beginn der experimentellen Phase III, ca. Es wurde festgestellt, dass B. caroliniensis in größerer relativer Häufigkeit vorkommt als Ca. B. sinica in Biofilmen, die sich an der Reaktorwand bilden (Abb. 4). Ca. Jettenia zeigte ebenfalls eine Erholung, wenn auch in geringer Häufigkeit (beobachtet in Wandproben) in Abwesenheit von Nitrit (Abb. 4). Obwohl nicht bestätigt werden kann, ob dies eine Folge des Nitritabbaus in Phase II war, sind die relativen Häufigkeiten von Ca. B. caroliniensis und Ca. Die Jettenien im von der Wand gesammelten Biofilm waren höher als im Normalbetrieb (Phase I in Abb. 6). Eine klare Umkehr von Ca. B. caroliniensis bis Ca. B. sinica wurde beobachtet, sobald Nitrit zwischen 650 und 680 Tagen wieder eingeführt wurde (Abb. 4). Ähnlich zu dem in Phase II festgestellten Anstieg der relativen Häufigkeit von Ca. B. sinica fiel mit der Wiederherstellung der nitritabhängigen Ammoniumoxidationsaktivität von 1163 mg N g MLVSS−1 Tag−1 zusammen, was mit der in Phase I vergleichbar ist (1352 mg N g MLVSS−1 Tag−1) (Abb. 4) . Darüber hinaus sank auch die NO-abhängige Ammoniumoxidationsaktivität von 440 (Phase II) auf 102 (Phase III) mg N g MLVSS−1 Tag−1 (Abb. 5), was weiter darauf hindeutet, dass ein erhöhter NO-Verbrauch wahrscheinlich damit zusammenhängt erhöhte Häufigkeit von Ca. B. caroliniensis oder Ca. Jettenia oder beides. Ein längerer Zeitraum unter Nitritbegrenzung hätte die Ca-Gewinnung weiter steigern können. Jettenia und Ca. B. caroliniensis verdrängt Ca. B. sinica. Dennoch unterstützt dieser Teil der Studie einen Zusammenhang zwischen Nitrit und NO, der Artenauswahl und ihrem bevorzugten Wachstumsmodus.

Verteilung der dominanten OTUs, die mit Ca verbunden sind. B. sinica und Ca. B. caroliniensis, zusammen mit anderen Anammox-Bakterien, die zu Brocadiaceae gehören, und Nicht-Anammox-Bakterien an der Wand (äußere Schicht) und in Suspension (innerer Kern) von (A) R1 am Tag 289 (B), R2 am Tag 265 (C) und R3 am Tag 266 (D). Die detaillierte Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft finden Sie in der ergänzenden Abbildung S3, Hintergrundinformationen.

Die vorherrschenden Anammox-Bakterien zeigten unter den verschiedenen Anreicherungsbedingungen auch eine deutliche Präferenz für anhaftendes Wachstum. Die Biomasse der Anammox-Bakterien war in R1 und R2 hauptsächlich als suspendiertes Granulat vorhanden, während in R3 an der Reaktoroberfläche anhaftende Biofilme dominierten (ergänzende Abbildung S2). Nach der Übertragung des Biofilms von der Reaktorwand in die Suspension (wie durch die gepunktete Linie in Abb. 1A–C dargestellt) wurde im Vergleich zu ein stärkerer Anstieg des MLVSS von R3 (ca. 1,5 g L−1 am Tag 230) beobachtet die anderen beiden Reaktoren (weniger als 0,3 g L−1 an den Tagen 160, 209 und 258 in R1 und 153, 216 und 253 in R2), was auf ein stärkeres anhaftendes Biofilmwachstum im primären abwassergespeisten Reaktor hindeutet (R3, Abb. 1C). Darüber hinaus wurde nach der Wiedereinführung von Nitrit in R2 während der experimentellen Phase III, Ca. B. sinica zeigte einen Abwärtstrend, der in den von den Wänden des Reaktors gesammelten Biofilmproben (Abb. 4) deutlicher zu erkennen war als in Suspension (p = 0,038). Der Unterschied in der relativen Häufigkeit zwischen Wand- und Suspensionsproben weist auf eine Bevorzugung von Ca hin. B. caroliniensis für anhaftendes Wachstum. Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen den Anammox-Bakterienpopulationen der von der Wand und der Suspension gesammelten Biomasseproben in R1 und R2 mit Ca. B. sinica als dominantes Anammox-Bakterium. Allerdings ist die relative Häufigkeit des vorherrschenden Ca. B. caroliniensis war in der von der Wand gesammelten Biomasse viermal häufiger als in der Suspension für R3 (Abb. 6), was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass diese Art eine Tendenz zum anhaftenden Wachstum aufweist (Abb. 6). Während festgestellt wurde, dass sich in R1 und R2 (Abb. 3A, B) Granulat bildete, mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 1,52 und 1527,9 ± 0,078 μm (Ergänzungstabelle S2) bzw. mit R = 0,35 (p = 0,006) zwischen den beiden Reaktoren, Die Morphologie der Aggregate in R3 war flockenartiger (Abb. 3C) mit einer Partikelgröße von 310,4 ± 0,2 μm (Ergänzungstabelle S2) mit R = 0,67 (p = 0,001) im Vergleich zu den beiden anderen Reaktoren. Daher scheint es, dass das Ca. B. caroliniensis, angereichert unter häuslichen Abwasserbedingungen mit organischem Kohlenstoff, kann die Granulatreifung nicht unterstützen und bildet stattdessen im Gegensatz zu Ca Biofilme an Wänden. B. sinica, der hauptsächlich in der körnigen Biomasse nachgewiesen wurde.

Die verschiedenen Anreicherungsstrategien führten auch zu diskreten Nicht-Anammox-Bakteriengemeinschaften in allen drei Reaktoren, mit einer höheren Häufigkeit von Nicht-Anammox-Bakterien-OTUs in R3 im Vergleich zu R1 und R2 (Abb. S1G, H und I). Die Ergänzung der Kohlenstoffquelle erhöhte den Reichtum (Ergänzungstabelle S1) in der mikrobiellen Gemeinschaft in R3 (Chao1: 614 ± 42), reicherte sie jedoch selektiv für die Nicht-Anammox-Bakteriengemeinschaft (Simpson 1-D: 0,04 ± 0,01) und nicht für die Anammox-Bakteriengemeinschaft (Simpson) an 1-D: 0,75 ± 0,17). Ein geringerer Reichtum wurde beobachtet, wenn Nitrit und Ammonium als Hauptsubstrate in R1 und R2 verwendet wurden (Chao1: 233 ± 31 bzw. 249 ± 32). Die Ergänzung mit NO führte zu einer etwas höheren Fülle, aber zu einer geringeren Gleichmäßigkeit in R2 als in R1. Ca. B. sinica korrelierte positiv mit OTUs, die mit nicht klassifizierten Fimbriimonadia (Phylum Armatimonadetes) und nicht klassifizierten Anaerolineaceae (Phylum Chloroflexi) in R1 assoziiert sind (Spearman-Rho > 0,8, p < 0,001). Während die relative Häufigkeit von Nicht-Anammox-Bakterien in Gegenwart von NO verringert wurde, wurde in R2 dennoch die gleiche Korrelation beobachtet. Allerdings wurde in R3 die Nicht-Anammox-Bakteriengemeinschaft durch OTUs ersetzt, die mit nicht klassifizierten Comamonadaceae (Phylum Proteobacteria) und nicht klassifizierten Bacteroidetes verbunden sind, und es wurde eine negative Korrelation zwischen nicht klassifizierten Bacteroidetes und Ca beobachtet. B. caroliniensis (Spearman-Rho: − 0,7, p < 0,001). Bemerkenswert ist, dass zur Familie der Comamonadaceae gehörende Taxa in R1 und R2 nahezu nicht vorhanden waren, während sie sowohl an der Reaktorwand als auch in Suspension in R3 die dominierende heterotrophe Gemeinschaft in der Biomasse blieben, was möglicherweise darauf hindeutet, dass diese Taxa metabolische Wechselwirkungen mit Ca haben. B. caroliniensis und spielen eine Rolle bei der Biofilmbildung (Ergänzende Abbildung S3).

Um Populationen mit den gewünschten physiologischen und Wachstumseigenschaften auszuwählen, müssen die Faktoren beschrieben werden, die die Nischendifferenzierung von Anammox-Bakterien vorantreiben. Dies kann die Prozesskontrolle und die Betriebsstabilität verbessern. Mit Ca assoziierte Anammox-Bakterien-OTUs. Brocadia, Ca. Kuenenia, Ca. Anammoxoglobus und Ca. Jettenia OTU wurden alle in Abwasseraufbereitungssystemen nachgewiesen3. Hier wurden Anammox-Bakterienpopulationen aus demselben Belebtschlamm-Inokulum ausgewählt. Dies wurde durch die Bereitstellung verschiedener Substrate (z. B. Ammonium, Nitrit, organischer Kohlenstoff und NO) in unterschiedlichen Konzentrationen und Belastungen erreicht, die für Haupt- und Nebenstrom-PN/A-Systeme relevant sind. Die reproduzierbare Anreicherung von zwei wichtigen Anammox-Bakterienarten, Ca. B. caroliniensis und Ca. B. sinica, wurde aus einem einzigen Samenbelebtschlamm aus den Tropen gewonnen und ihre bevorzugten ökologischen Nischen beschrieben. Ca. B. caroliniensis dominierte in allen Reaktoren bei einer N-Beladung < 500 mg NL−1 Tag−1 und niedrigeren N-Konzentrationen (zufließende Ammonium- und Nitritkonzentrationen von weniger als 200 bzw. 250). Eine Erhöhung der N-Belastung und -Konzentration führte zu einer Sukzession hin zu Ca. B. sinica. Ca. B. caroliniensis war auch die wettbewerbsfähigste Art in Gegenwart von organischem Kohlenstoff, wie ihre Prävalenz in R3 unter Bedingungen geringer N-Belastung zeigt.

Es ist möglich, dass Ca. B. caroliniensis und Ca. B. sinica entwickelte ihre eigene Nische aufgrund der unterschiedlichen Anfälligkeit für Nitrithemmung, da die Nitritkonzentration erhöht wurde, um die N-Belastung zu erhöhen. Eine Bevölkerungsverschiebung von ca. B. caroliniensis bis Ca. B. sinica wurde durchgängig bei steigender Nitritkonzentration über 340 mg NO2–NL–1 im Zulauf (d. h. 170 mg NO2–NL–1 im Reaktor) beobachtet. Obwohl dies im Bereich der für Anammox-Bakterien berichteten Hemmkonzentrationen von 40 bis 400 mg NL−116,17,18,30,31,32 liegt, wurde eine solche Verschiebung bisher auf Artenebene nicht untersucht.

Eine alternative Erklärung für diese Verschiebung könnte sein, dass Ca. B. caroliniensis und Ca. B. sinica haben unterschiedliche intrinsische kinetische Eigenschaften. Unter Verwendung angereicherter Planktonzellen wurden die Nitrit-Affinitätskonstante und die spezifische Wachstumsrate von Ca ermittelt. Für B. sinica wurden 0,47 mg NL−1 und 0,33 Tag−1 (entsprechende Verdopplungszeit von 2,1 Tagen)29,33 ermittelt, was die höchste maximale Wachstumsrate darstellt, die jemals für Anammox-Bakterien berichtet wurde. Dies weist darauf hin, dass Ca. B. sinica sind R-Strategen und würden bei hohen N-Beladungsraten und Ammonium- und Nitritkonzentrationen wachsen33, wie in unserer Studie beobachtet. Allerdings ist eine ähnliche Schätzung für Ca. B. caroliniensis fehlt. Die metagenomische Analyse ergab, dass Ca. B. caroliniensis verfügt über mehrere Kopien von Nitrit-/Formiattransportern (focA), die aufgrund einer niedrigen intrinsischen Nitrit-Affinitätskonstante einen Wettbewerbsvorteil bei niedrigen Nitritkonzentrationen bieten14. Dies könnte ihnen möglicherweise dabei helfen, Nitrit aus heterotrophen Denitrifizierern abzufangen, insbesondere wenn die Konkurrenz um Nitrit in Gegenwart von organischem Kohlenstoff größer ist.

Trotz des breiten Spektrums an Umgebungsbedingungen, die in den drei Anreicherungsreaktoren gelten, ist Ca. Brocadia blieb während des gesamten Anreicherungsprozesses der dominanteste Phylotyp, während Ca. Kuenenia und Ca. Anammoxoglobus, die häufig in technischen Systemen vorkommen, wurden nicht nachgewiesen. Obwohl die Häufigkeit aller Anammox-Bakterien im Inokulum gering war, trugen die Betriebsbedingungen, insbesondere die relativ hohe Stickstoffbelastung, zur Anreicherung von Ca bei. Brocadia über andere34.

NO wurde in R2 bereitgestellt, um oxidativen Stress auszuüben und möglicherweise auch auf NO-nutzende Anammox-Bakterien zu selektieren35. Während die Anwesenheit von NO das Wachstum von Anammox-Bakterien offenbar nicht unterdrückte, könnte es Ca einen Wettbewerbsvorteil verschafft haben. Jettenia in R2, das zusammen mit Ca auf eine maximale relative Häufigkeit von 23 % anstieg. B. caroliniensis bei geringer N-Beladung (Abb. 1). Über die ökologischen und metabolischen Treiber der Ca-Nische ist wenig bekannt. Jettenia, wahrscheinlich weil sie im Allgemeinen weniger häufig vorkommen als andere Gattungen von Anammox-Bakterien3. Es wurde gezeigt, dass niedrige Nitritkonzentrationen die Vermehrung von Ca fördern. Jettenia über Ca. B. sinica4, im Einklang mit dieser Studie. Allerdings ca. Jettenia kam viel seltener vor als Ca. B. caroliniensis bei niedrigen Nitritbeladungsraten. Dennoch sind zwei phylogenetisch weit voneinander entfernte Anammox-Bakterienarten, Ca. B. caroliniensis und Ca. Es wurde gezeigt, dass Jettenia im selben System koexistiert, was die vorherigen Erkenntnisse stützt3. Da die Überwachung der mikrobiellen Gemeinschaft jedoch nur auf dem 16S-rRNA-Gen basiert, kann es zu einer Verzerrung kommen, wenn man sich auf eine einzelne Region des Gens konzentriert. Eine weitere Validierung mithilfe eines Mehrfachprimer-Sequenzierungsansatzes könnte durchgeführt werden, um die Genauigkeit der Quantifizierung zu verbessern 36.

Die Koevolution von Ca. B. caroliniensis und Ca. Jettenia könnte auch vorschlagen, dass Ca. B. caroliniensis könnte NO verwerten. Ein ähnlicher Nitritreduktionsweg in Ca. B. caroliniensis und Ca. Jettenia wurde vorgeschlagen, nachdem in der metagenomischen Analyse von Ca ein nirK-Homolog nachgewiesen wurde. B. caroliniensis14,37. Der signifikante Anstieg der NO-abhängigen Ammoniumoxidation nach der Nitritbegrenzung ging mit der Gewinnung von Ca einher. B. caroliniensis und Ca. Jettenia-Populationen. Eine aktuelle Studie berichtete über die Entdeckung von nirS in einem Ca. Brocadia-Genom38, jedoch wurden nur schwache Transkripte gefunden und diese Beobachtung erfordert eine zusätzliche Validierung. Es ist denkbar, dass Ca. B. caroliniensis nutzt ein NirK-Homolog oder eine neuartige Nitritreduktase, die den herkömmlichen NO-abhängigen Weg zur Hydrazinproduktion nutzt, oder besitzt die Fähigkeit, in Abwesenheit von Nitrit auf einen NO-abhängigen Weg umzuschalten. Ein alternativer Weg für die NO-Produktion durch Oxidation von Hydroxylamin durch ein Hydroxylamin-Oxidoreduktase (Hao)-ähnliches Protein wurde tatsächlich von Park et al.14 und Irisa et al.39 entdeckt. Sie schlugen vor, dass dieser alternative Weg möglicherweise unter Nitritlimitierung aktiviert werden könnte14. Es wurde auch gezeigt, dass NO unter Nitritbegrenzung in Ca Ammonium zu Distickstoffgas oxidiert. B. fulgida21 und kanonisches nirS fehlten in seinem Genom40.

Im Gegensatz dazu war die NO-abhängige Ammoniumoxidation bei deutlich höheren NO-Konzentrationen vernachlässigbar, was die Behauptung weiter untermauert, dass Nitrit anstelle von NO der bevorzugte Elektronenakzeptor war und dass die Entfernung von Ammonium durch Ca nicht erreicht werden kann. B. sinica über direkte Kopplung zur NO-Reduktion (Abb. 5). Während Ca. B. sinica wurde in Abwesenheit von Nitrit nicht vollständig gehemmt, seine relative Häufigkeit nahm unter Nitritlimitierung ab, wie bereits erwähnt. Dies unterstützt die Studie von Oshiki et al.41, die zeigt, dass Ca. B. sinica nutzt für die Hydrazinsynthese kein NO und Ammonium, sondern Hydroxylamin und Ammonium. Shaw et al.42 zeigten mithilfe von 15N-Markierungsexperimenten, dass Ammonium über Hydroxylamin als Zwischenprodukt anstelle von NO in einem Ca zu Distickstoff oxidiert wurde. Brocadia-Anreicherungskultur mit einer Elektrode als Elektronenakzeptor. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass es ohne Reinkulturen nicht möglich ist, Verhaltensweisen Arten mit absoluter Sicherheit zuzuordnen. Alle Anammox-Bakterien sind nicht kultivierbar, und die einzige Möglichkeit, Verhaltensweisen bestimmten Arten zuzuordnen und ihre Nischen und optimalen Wachstumsbedingungen zu identifizieren, sind phänomenologische Studien an Anreicherungsreaktoren. Dabei wurden Anreicherungen zwischen 50 und 80 % erreicht, was für einen Populationsanreicherungsreaktor ein hoher Wert ist43; Sie zählen zu den höchsten Anammox-Anreicherungen, die bisher in einem SBR erreicht wurden44. Eine Anreicherung auf 99,5 % kann durch Percoll-Dichtezentrifugation45 erreicht werden, die erforderliche hohe Biomasse erschwert jedoch die Auflösung der mikrobiellen Gemeinschaft auf Artenebene. Während Membranbioreaktoren zur Anreicherung planktonischer Ca-Populationen eingesetzt wurden. B. sinica, Ca. Scalindua29 und Ca. K. stuttgartsiensis10, unser Ansatz wurde auch für Arten bereichert, die bevorzugt in Biofilmen wachsen, wie B. caroliniensis und Ca. Jettenia.

Aufgrund der langsamen Wachstumsrate dieser Bakterien ist eine hohe Retention von Anammox-Bakterien in Reaktoren ein entscheidender Faktor für einen optimalen Betrieb. Dies kann durch die Anlagerung von Biofilmen an Träger, die Bildung körniger Biomasseaggregate und andere Trenntechniken wie Membranfiltration erreicht werden, um das Auswaschen von Anammox-Bakterien zu verhindern. Die Wahl der Biomasseretention in Anammox-Systemen kann von der Wachstumsart der vorherrschenden Anammox-Bakterienarten und der koexistierenden mikrobiellen Gemeinschaft unter bestimmten Betriebsbedingungen abhängen. In dieser Studie wurde gezeigt, dass die Anammox-Bakteriengemeinschaft und ihre Aggregationszustände unter Mainstream- und Sidestream-Bedingungen unterschiedlich sein können. Ca. B. caroliniensis, das unter normalen Bedingungen wahrscheinlich fortbesteht, zeigte eine Vorliebe für das Wachstum anhaftender Biofilme. Eine hohe Diversität und Häufigkeit heterotropher Arten in R3 wurde auch in Gegenwart von komplexem organischem Kohlenstoff beobachtet. Insbesondere Comamonadaceae blieben sowohl in Suspension als auch im Biofilm einer der am häufigsten vorkommenden Heterotrophen im System. Comamonadaceae kommen häufig in Biofilm-bildenden Gemeinschaften vor46,47, was darauf hindeutet, dass sie möglicherweise eine Rolle bei der Unterstützung der Biofilmbildung spielen. Anhaftendes Wachstum von Ca. B. caroliniensis wurde auch in einem großtechnischen Prozess beobachtet, bei dem anaerobe Faulflüssigkeit mit Glycerin als externer Kohlenstoffquelle behandelt wurde14. In diesem Fall können Träger verwendet werden, um eine große Oberfläche bereitzustellen und so eine hohe Biomasseretention zu erreichen48. Träger, die das Wachstum von anhaftendem Biofilm unterstützen, können in verschiedenen Konfigurationen eingesetzt werden, beispielsweise in rotierenden biologischen Kontaktoren49, Biofilmreaktoren mit beweglichem Bett50,51 und Batch-Biofilmreaktoren mit Sequenzierung52. Allerdings ca. B. sinica dominiert Anammox-Biofilme, die Granulat bilden (wie in R1 und R2 beobachtet, die unter Seitenstrombedingungen betrieben werden) und können physikalisch mithilfe eines Hydrozyklons wie bei DEMON SBR-Systemen53, Lamellenabscheidern54 oder integrierten Festfilm-Belebtschlamm-Konfigurationen (IFAS) mit a abgetrennt werden Siedler55. Es wurde festgestellt, dass ein bestimmtes extrazelluläres Protein in der extrazellulären Matrix des Ca sehr häufig vorkommt. B. sinica-Granulat, das aufgrund seiner Fähigkeit zur Phasentrennung (Tröpfchen und Gele) und der Adhäsionsförderung die Biofilmbildung über mehrere Längenskalen fördert56. Dies könnte die größere Tendenz von Ca erklären. B. sinica zur Selbstaggregation (d. h. in Abwesenheit eines Substrats, im Gegensatz zu Ca. B caroliensis und Ca. Jettenia). Trotz des Fehlens von extern zugeführtem organischem Kohlenstoff vermehrten sich Heterotrophe der Klasse Fimbriimonadia (Stamm Armatimonadetes) und der Familie Anaerolineaceae (Stamm Chloroflexi) in R1 und R2 mit einer relativen Häufigkeit von 10–15 %. Gao et al.57 schlugen eine wichtige Rolle von Anaerolineaceae als Kerne oder Träger für die Granulatbildung im Anammox-Schlamm vor und ihre Zunahme der Häufigkeit im Laufe der Zeit lässt darauf schließen, dass sie die Granulierung sowohl in R1 als auch in R2 unterstützt haben könnten. Allerdings kann die Rolle heterotropher Bakterien und ihre Interaktion mit Anammox-Bakterien in dieser Studie nicht vollständig aufgeklärt werden und bedarf weiterer Untersuchungen.

Aus demselben Belebtschlamm können mehrere Anammox-Bakterienarten angereichert werden. Ca. B. caroliniensis dominiert bei niedrigen N-Belastungen, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von organischem Kohlenstoff und unter Nitritlimitierung, und bildet anhaftende Biofilme; Ca. B. sinica verdrängt es bei höheren N-Belastungen und bildet Granulat; und eine NO-Ergänzung fördert Ca Jettenia, obwohl es bei hohen Nitratkonzentrationen immer noch verschwindet. So, Ca. B. caroliensis dominiert wahrscheinlich in Mainstream-Abwasser-Anammox-Prozessen, wo Träger die beste Biofilm-Retentionsstrategie wären, Ca B. sinica in Nebenstrombehandlungen mit Granulat die beste Retentionsstrategie und Ca Jettenia in Abwasserbehandlungssystemen wahrscheinlich nicht konkurrenzfähig sein dürfte. Insgesamt bietet diese Studie Einblicke in das Verständnis der Beziehung zwischen Artenauswahl, Wachstumsmorphologie und Prozessbedingungen in Haupt- und Nebenstromanwendungen mit wichtigen Auswirkungen auf die Prozessgestaltung, Steuerung und Verwaltung des Anammox-Prozesses auf Artenebene in Abwasseraufbereitungssystemen im Originalmaßstab.

Hier wurden drei Plexiglas-Sequenzierungs-Batch-Reaktoren (SBRs) mit einem Arbeitsvolumen von jeweils 4 L (140 mm Innendurchmesser, 260 mm Höhe) verwendet und mit einem oben montierten Rührrad (30 mm Radius) bei 200 U/min gerührt. Sie wurden mit Belebtschlamm aus einer voll ausgestatteten Wasseraufbereitungsanlage (WRP) geimpft, die in Singapur eine biologische Nährstoffentfernung durchführt und häusliches und industrielles Wasser aufbereitet. R1 und R2 wurden mit synthetischem Medium ohne organischen Kohlenstoff gefüttert, während R3 einmal wöchentlich Primärabwasser aus dem WRP erhielt, das eine komplexe organische Kohlenstoffquelle enthielt. Das synthetische Medium wurde wie folgt hergestellt (g L−1): KHCO3 1,25, KH2PO4 0,025, CaCl2·6H2O 0,3, MgSO4·7H2O 0,2 und FeSO4·7H2O 0,025 mit allmählichem Anstieg der Ammonium- (von 30 auf 280 mg NL−1) und Nitritkonzentration (39–350 mg NL−1) und 1,25 ml L−1 Spurenelementlösung, wie von van de Graaf et al.58 beschrieben. Argon/CO2 (95/5 %) wurde während der gesamten anoxischen Phase kontinuierlich mit 25 ml min−1 eingeleitet, um das Eindringen von Sauerstoff in R1 zu verhindern, wohingegen R2 sowohl mit Argon/CO2 als auch NO mit einer kombinierten Durchleitungsrate von 25 ml min− gespült wurde 1 auf eine endgültige NO-Gasphasenkonzentration von 400 ppmv, um oxidativen Stress auszuüben. Die ausgewählte Konzentration von 400 ppmv lag unter der zuvor gemeldeten Toleranzschwelle von 600 ppmv für Anammox-Bakterien22. R1 und R2 wurden in Zyklen von 12 Stunden betrieben, wobei jeder Zyklus aus 5 Minuten Zuführung, 108 Minuten anoxischem Zyklus und 67 Minuten Absetzen und Dekantieren bestand. Die anfänglichen Ammonium- und Nitritkonzentrationen wurden im Reaktor in den ersten sieben Wochen bei 20 mg NL−1 gehalten, was zu einer hydraulischen Verweilzeit (HRT) von 24 Stunden führte (jedem Zyklus wurden zwei Liter synthetisches Abwasser in den Reaktor eingespeist). Nach Erreichen einer 100-prozentigen Ammoniumentfernung wurden die NH4+- und NO2−-Konzentrationen im Futter in Schritten von 20 mg NL−1 erhöht. Das einströmende NO2−:NH4+ wurde in einem Molverhältnis von 1,3 nahe der theoretischen Stöchiometrie gehalten59. Die HRT wurde entsprechend der N-Entfernungskapazität schrittweise von 24 auf 16 Stunden für R1 und von 24 auf 12 Stunden für R2 verringert. Daher wurde R2 im Vergleich zu R1 mit einer höheren N-Beladungsrate betrieben, da die Zykluszeit kürzer war und höhere N-Entfernungsraten in R2 einhergingen. Der pH-Wert wurde weder in R1 noch in R2 kontrolliert und schwankte zwischen 7,2 und 7,8.

R3 wurde in Zyklen von 8–12 Stunden betrieben, wobei jeder Zyklus aus 2 Stunden Zuführung, 5–9 Stunden anoxischer Phase (abhängig von der angewandten Zykluslänge) und 1 Stunde Absetzen und Dekantieren bestand. Vor dem Absetzen wurde der Reaktor 5 Minuten lang mit Argon/CO2 gespült, um das während der anoxischen Phase erzeugte Stickstoffgas zu entfernen und so die Absetzfähigkeit des Schlamms zu verbessern. In jeder Fütterungsperiode wurden 2 l mit Nitrit angereichertes Primärabwasser zugesetzt, was zu einer HRT von 16–24 Stunden führte. Nitrit wurde entsprechend der Ammoniumkonzentration in einem Molverhältnis von 2:1 eingestellt und in einem Kühlschrank bei 4 °C gelagert, um den Abbau zu minimieren. Die Nährstoffzusammensetzung des Primärabwassers wurde nach Zugabe von Nitrit gemessen. Die Durchschnittswerte sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Es wurde eine langsame Zufuhr von 2 Stunden angewendet, um den Sauerstoffeintrag und den Temperaturschock durch das im Kühler gespeicherte Primärabwasser zu minimieren. Der pH-Wert des Reaktors wurde nicht kontrolliert und schwankte aufgrund der Denitrifikationsaktivität zwischen 7,6 und 8,5. Zu Anreicherungszwecken wurde die SRT nicht in allen drei Reaktoren kontrolliert, sodass Schlammverluste nur durch Probenahme für Nährstoff- und Feststoffanalysen auftraten (SRT wurde auf > 20 Tage geschätzt).

Ein Heizmantel wurde angeschlossen, um den SBR für R1 und R2 auf 35 ± 0,05 °C und für R3 auf 33 ± 1 °C zu halten. Die Konzentration von gelöstem Sauerstoff (DO) und der pH-Wert wurden kontinuierlich mit dem Mettler Toledo InPro6050 DO-Sensor bzw. dem Mettler Toledo-InPro 3250i pH-Sensor überwacht. Am Ende des Zyklus wurden regelmäßig Proben gesammelt und sofort mit 0,2-µm-Filtern für Nährstoffanalysen gefiltert. Gemischte Flüssigkeitsproben wurden in der Mitte der anoxischen Phase zur DNA-Extraktion gesammelt. Um die mikrobielle Zusammensetzung des Biofilms auf der Reaktoroberfläche zu bestimmen, wurden Biomasseproben von der Wand an drei zufälligen Stellen nach dem Entleeren des Reaktors am Tag 289 für R1, am Tag 265 für R2 und am Tag 266 für R3 gesammelt. Sowohl die gesammelten Suspensions- als auch die Biofilmproben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Extraktion bei –80 ° C gelagert. Der Biofilm auf der Oberfläche des Reaktors wurde regelmäßig gereinigt, um die Konzentration der gesamten suspendierten Feststoffe der gemischten Flüssigkeit (MLSS) und der flüchtigen Fraktion (MLVSS) sowie den Anteil der suspendierten Biomasse im Vergleich zum anhaftenden Wachstum zu bestimmen. Außerdem wurden Proben suspendierter Biomasse für die Partikelgrößenanalyse gesammelt und eine lichtmikroskopische Bildgebung durchgeführt, nachdem eine stabile Anreicherung erreicht wurde.

Um die Wirkung von NO als Selektionsdruck für die Auswahl von Anammox-Bakterienarten weiter zu validieren, wurde R2 einer allmählichen Nitritabreicherung und -auffüllung unterzogen, während die Verfügbarkeit von NO als Elektronenakzeptor über drei experimentelle Phasen hinweg aufrechterhalten wurde, nachdem ein stabiler Betrieb erreicht wurde: Phase I – Normalbetrieb vor dem Nitritabbau betrugen die Ammonium- und Nitritkonzentrationen im Futter 280 bzw. 350 mg NL−1, bei kontinuierlicher Zufuhr von NO bei 400 ppmv in der Gasphase (vor Tag 563); Phase-II-Nitrit-begrenzter Betrieb (Tag 564–640), wobei Nitrit schrittweise von 50 auf 0 mg NO2-NL-1 reduziert wurde, während Ammonium und NO bei 50 mg NH4-NL-1 bzw. 400 ppmv gehalten wurden; In Phase III (Tag 640–687) wurde Nitrit schrittweise von 0 auf 70 mg NO2–NL−1 mit den oben genannten Ammonium- und NO-Konzentrationen in Phase II wieder eingeführt. Während des gesamten Experiments wurden zweimal pro Woche suspendierte Biomasseproben aus der gemischten Flüssigkeit entnommen, an der Wand haftender Biofilm wurde jedoch aufgrund der begrenzten Menge an Wandbiomasse erst ab Phase III gesammelt. In jeder Versuchsphase wurden Chargenaktivitätstests dreifach mit 80 mg NH4+–NL−1, 100 mg NO2–NL−1 und/oder 400 ppmv NO in der Gasphase unter den folgenden Bedingungen durchgeführt, wobei (i) nur Ammonium und Nitrit verwendet wurden. (ii) Ammonium, Nitrit und NO und (iii) nur Ammonium und NO vorhanden. Als Kontrolle diente die Anammox-Aktivität von R1 im Normalbetrieb mit Ammonium und Nitrit als Substrat. Bei allen Batch-Aktivitätstests wurden alle 30 Minuten gemischte Flüssigkeitsproben entnommen und zur Nährstoffanalyse durch 0,22-µm-Milipore-Filter filtriert.

Alle zur Nährstoffanalyse entnommenen Proben wurden auf Ammonium, Nitrit und Nitrat gemessen. Ammonium wurde mit Hach®-Kits gemessen, Nitrat und Nitrit wurden mit Ionenchromatographie (Prominence, Shimadzu) analysiert. MLSS und MLVSS wurden gemäß den Standardmethoden60 analysiert. NO wurde in der Gasphase mit einem Online-Chemilumineszenzanalysator (Modell: 42i, Thermoscientific) gemessen. Die Partikelgrößenanalyse wurde mit einem Laserbeugungs-Partikelgrößenanalysator (Modell: SALD-MS30, Shimadzu) durchgeführt. Die ANOSIM-Analyse erfolgte anhand der Partikelgrößenmessungen an Proben aus verschiedenen Reaktoren.

Aus jedem Reaktor wurde suspendierte Biomasse gesammelt und einer Größenanalyse unterzogen. 1 ml Biomasse wurde auf der Oberfläche der Petrischale verteilt und die Bilder wurden mit dem inversen Epifluoreszenzmikroskop AxioObserver Z1 (Leica, Deutschland) mit Ziegel-/Siegelfunktion aufgenommen. Die Bilder wurden dann mit der Bild-J61-Funktion „Partikel analysieren“ analysiert.

Genomische DNA wurde aus Biomasseproben mit dem FastDNA™ SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, USA) mit Optimierung gemäß Albertsen et al. extrahiert. (2015). Die Paired-End-16S-rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung wurde von DNAsense (http://dnasense.com/) an der Universität Aalborg (Dänemark) mit den Primersätzen 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) und 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT) durchgeführt. 3′) (Caporaso et al. 2011) von Illumina Miseq-Plattform, wie in Law et al. beschrieben. (2016). Eine detaillierte Datenanalyse finden Sie in den unterstützenden Informationen (SI).

Um die Identifizierung der Taxonomie auf Artenebene weiter zu bestätigen, wurden vier 16S-rRNA-Genklonbibliotheken aus Proben erstellt, die an den Tagen 74, 280 von R1 und 85, 270 von R2 gesammelt wurden. Aus der Klonbibliothek und der 16S-rRNA-Amplikonsequenzierung erhaltene Sequenzen wurden verwendet, um durch ARB einen phylogenetischen Baum zu erstellen. Methoden zur Klonbibliothek und zum Aufbau phylogenetischer Bäume sind in SI ausführlich beschrieben.

Proben suspendierter Biomasse wurden gesammelt und über Nacht mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) fixiert. Nach dem Waschen mit 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 130 mM Natriumchlorid, 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2) wurden die Biomasseproben mit 1:1 100 % Ethanol:1 × PBS bei –20 °C gelagert. FISH wurde an zerkleinerten Biomasseproben gemäß der von Daims et al.62 beschriebenen Methode mit den in Tabelle 1 aufgeführten Sonden durchgeführt. Die Objektträger wurden unter Verwendung eines inversen konfokalen Zeiss LSM 780-Mikroskops (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) betrachtet.

Alle in diesem Manuskript verwendeten rohen 16S-rRNA-Amplikonsequenzen sind in NCBI unter Bioproject PRJNA604076 verfügbar. Kontaktieren Sie den korrespondierenden Autor Thomas Seviour ([email protected]), um Daten aus dieser Studie anzufordern.

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Diese Forschung wurde von der Singapore National Research Foundation und dem Bildungsministerium im Rahmen des Research Centre of Excellence Programme sowie durch einen Programmzuschuss der National Research Foundation (NRF), Projektnummer 1301-IRIS-59, unterstützt. Wir möchten Herrn Larry Liew und den Mitarbeitern des Public Utilities Board (PUB) von Singapur für die wöchentliche Sammlung des Primärabwassers sowie Herrn Eganathan Kaliyamoorthy für seine Hilfe bei der Durchführung der Feststoffanalyse danken.

Yang Lu

Aktuelle Adresse: The Australian Centre for Ecogenomics, School of Chemistry and Molecular Biosciences, University of Queensland, St. Lucia, QLD, 4072, Australien

Thi Quynh Ngoc Nguyen

Derzeitige Adresse: Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung, Singapur, 138632, Singapur

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Yang Lu und Gayathri Natarajan.

Singapore Centre for Environmental Life Sciences Engineering, Nanyang Technological University, Singapur, 637551, Singapur

Yang Lu, Gayathri Natarajan, Thi Quynh Ngoc Nguyen, Sara Swa Thi, Krithika Arumugam, Thomas Seviour, Stefan Wuertz und Yingyu Law

Zentrum für Wassertechnologie (WATEC) und Abteilung für Bio- und Chemieingenieurwesen, Universität Aarhus, Universitetsbyen 36, 8000, Aarhus C, Dänemark

Thomas Seviour

Singapore Centre for Environmental Life Sciences Engineering, National University of Singapore, Singapur, 119077, Singapur

Rohan BH Williams

Fakultät für Bau- und Umweltingenieurwesen, Nanyang Technological University, Singapur, 639798, Singapur

Stefan Würtz

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TS, YYL und YL haben das Manuskript geschrieben und Experimente entworfen, RW, YL und KA analysierten Sequenzierungsdaten, GN, TN und ST verwalteten und sammelten experimentelle Daten, YL und GN analysierten die experimentellen Daten. Alle Autoren haben zur Bearbeitung des Artikels beigetragen.

Korrespondenz mit Thomas Seviour.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lu, Y., Natarajan, G., Nguyen, TQN et al. Steuerung der Anammox-Speziations- und Biofilm-Anlagerungsstrategie mithilfe von N-Biotransformationszwischenprodukten und organischen Kohlenstoffgehalten. Sci Rep 12, 21720 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26069-2

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Eingegangen: 19. Oktober 2022

Angenommen: 08. Dezember 2022

Veröffentlicht: 15. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26069-2

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