Gleichzeitige Sulfid- und Methanoxidation durch ein Extremophil

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2974 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Schwefelwasserstoff (H2S) und Methan (CH4) entstehen in anoxischen Umgebungen durch Sulfatreduktion und Zersetzung organischer Stoffe. Beide Gase diffundieren nach oben in oxische Zonen, wo aerobe Methanotrophe die CH4-Emissionen verringern, indem sie dieses starke Treibhausgas oxidieren. Obwohl Methanotrophe in unzähligen Umgebungen giftigem H2S ausgesetzt sind, ist es praktisch unbekannt, wie sie davon betroffen sind. Hier zeigen wir durch umfangreiche Chemostat-Kultivierung, dass ein einzelner Mikroorganismus CH4 und H2S gleichzeitig mit gleich hohen Geschwindigkeiten oxidieren kann. Durch die Oxidation von H2S zu elementarem Schwefel mildert der thermoacidophile Methanotrophe Methylacidiphilum fumariolicum SolV die hemmende Wirkung von H2S auf die Methanotrophie. Der Stamm SolV passt sich dem Anstieg von H2S an, indem er eine sulfidunempfindliche terminale Oxidase vom ba3-Typ exprimiert, und wächst chemolithoautotroph und nutzt H2S als einzige Energiequelle. Genomische Untersuchungen ergaben mutmaßlich sulfidoxidierende Enzyme in zahlreichen Methanotrophen, was darauf hindeutet, dass die H2S-Oxidation in Methanotrophen viel weiter verbreitet ist als bisher angenommen, was es ihnen ermöglicht, Kohlenstoff- und Schwefelkreisläufe auf neuartige Weise zu verbinden.

Schwefelwasserstoff (H2S) ist die am stärksten reduzierte Form von Schwefel (S) und eine starke Energie- und Schwefelquelle, ein Giftstoff und ein Signalmolekül1,2,3. Es handelt sich um eine schwache Säure, die leicht durch Membranen diffundiert und durch Bindung an Cytochrom-C-Oxidasen verschiedene Prozesse wie die aerobe Atmung hemmt. Darüber hinaus werden andere Stoffwechselprozesse, die kupfer- und eisenhaltige Enzyme nutzen, durch H2S1,4,5,6 stark gehemmt. Daher benötigen Mikroorganismen, die in sulfidreichen Umgebungen leben, geeignete Mechanismen zur Entgiftung von H2S7,8. In einer Vielzahl von Umgebungen, wie Feuchtgebieten, Meeressedimenten, Böden, Kläranlagen, Seen, Reisfeldern, Mülldeponien und sauren geothermischen Umgebungen, wird H2S durch Sulfat (SO42−)-Reduktion, Mineralisierung organischer Stoffe und Thermochemie erzeugt8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18.

Bei der Erschöpfung des Sulfats wird organisches Material in sauerstoffarmen Ökosystemen letztendlich in Methan (CH4) umgewandelt9,12,13,19,20,21. Wenn sowohl H2S als auch CH4 in die darüber liegenden oxischen Zonen diffundieren, kann CH4 von aeroben methanoxidierenden Bakterien als Energiequelle genutzt werden, von denen angenommen wird, dass sie die meisten Emissionen dieses starken Treibhausgases verringern22. Trotz dieses wirksamen Methan-Biofilters werden jährlich 548 bis 736 Tg CH4 aus verschiedenen natürlichen und anthropogenen Quellen in die Atmosphäre freigesetzt23,24. Aerobe Methanotrophe sind Teil verschiedener Bakterienklassen und -familien, darunter die allgegenwärtigen Alpha- und Gammaproteobakterien16,25,26, Actinobakterien27 und die extremophilen Methylacidiphilaceae des Stammes Verrucomicrobia28,29,30,31. Letztere sind azidophile Bakterien, die ein niedriges pH-Optimum (2,0 – 3,5) haben und zwischen 35 und 60 °C leben26,31,32. Alle bekannten verrukombiellen Methanotrophen wurden aus geothermischen Lebensräumen wie Fumarolen und Schlammtöpfen isoliert, aus denen große Mengen an meist thermogenem CH4 und H2S emittiert werden16,28,33,34,35. Geothermische Umgebungen zeichnen sich typischerweise durch hohe H2S-Emissionen aus und daher sind die aus diesen Ökosystemen isolierten verrukomikrobielle Methanotrophe sind herausragende Beispiele für die Untersuchung, wie Methanotrophe durch H2S beeinflusst werden.

Es wird immer deutlicher, dass Methanotrophe metabolisch vielseitig sind und umweltrelevante Energiequellen wie H2, Propan, Ethan, Acetat, Aceton, 2-Propanol und Acetol nutzen können16,36,37,38. Die Möglichkeit, verschiedene Energiequellen zu nutzen, ist in Umgebungen mit stark schwankenden Gasemissionen von großem Vorteil. Kürzlich wurde gezeigt, dass Reinkulturen des verrukomikrobiellen Methanotrophen Methylacidiphilum fumariolicum SolV Methanthiol (CH3SH) verbrauchen können, wobei gleichzeitig eine substöchiometrische Bildung von H2S einhergeht, was darauf hindeutet, dass der Stamm SolV das toxische H2S39 teilweise metabolisiert. Anschließend zeigte eine elegante Studie, dass auch proteobakterielle Methanotrophe H2S40 oxidieren können. Die Autoren isolierten den vielseitigen Alphaproteobakterium-Stamm HY1 „Methylovirgula thiovorans“ aus einem südkoreanischen Torfland, der auf Thiosulfat (S2O32−), Tetrathionat (S4O62−), elementarem Schwefel (S0) und einer Reihe von Kohlenstoffverbindungen wachsen konnte. Allerdings waren Zellen des Stammes HY1, die auf CH4 als einziger Energiequelle gezüchtet wurden, nicht in der Lage, H2S zu oxidieren, und die H2S-Oxidation wurde nur in Zellen eingeleitet und beobachtet, die in Gegenwart von Thiosulfat gezüchtet wurden. Darüber hinaus wurde das Wachstum auf H2S nicht untersucht. Angesichts aktueller Beobachtungen ist es von größter Bedeutung zu untersuchen, ob es Mikroben gibt, die die umweltrelevanten Gase CH4 und H2S gleichzeitig oxidieren können, wie Methanotrophe mit H2S umgehen und ob solche Methanotrophe Energie sparen und mithilfe von H2S als Energiequelle Biomasse produzieren können.

Hier zeigen wir durch umfangreiche Chemostat-Kultivierung zum ersten Mal, dass ein Mikroorganismus CH4 und H2S gleichzeitig oxidieren kann. M. fumariolicum SolV wird durch das Vorhandensein erhöhter H2S-Konzentrationen gehemmt, H2S wird jedoch als Entgiftungsmechanismus schnell zu elementarem Schwefel (S0) oxidiert, um die hemmende Wirkung von H2S auf die CH4-Oxidation zu mildern. Der Stamm SolV passt sich an H2S an, indem er eine Sulfid:Chinon-Oxidoreduktase (SQR) vom Typ III und eine H2S-unempfindliche Cytochrom-C-Oxidase vom Ba3-Typ hochreguliert und so einen Elektronentransferweg von H2S zu O2 schafft. Darüber hinaus enthält der Stamm SolV 13CO2 unter Verwendung von H2S als einziger Energiequelle. Wir gehen davon aus, dass die H2S-Oxidationskapazität verrukombieller Methanotrophe für das Gedeihen in schwefelreichen, sauren geothermischen Ökosystemen von wesentlicher Bedeutung ist. Darüber hinaus fanden wir SQR in einer Vielzahl von proteobakteriellen Methanotrophen verschiedener Umgebungen. Wenn man bedenkt, dass CH4 und H2S in einer Vielzahl von Ökosystemen mit begrenztem Sauerstoffgehalt nebeneinander existieren, könnte die H2S-Oxidation ein Merkmal sein, das bei vielen aeroben Methanotrophen vorhanden ist.

Der Nachweis von Genen, die mutmaßliche Sulfid-Chinon-Oxidoreduktasen (SQRs) kodieren, in den Genomen verrukombieller Methanotropher veranlasste uns zu untersuchen, ob Methanotrophe oxidieren und sich an H2S16 anpassen können. Dementsprechend wurde eine kontinuierliche Kultur des thermoacidophilen aeroben Methanotrophen Methylacidiphilum fumariolicum SolV (als Chemostat mit einer Verdünnungsrate (D) von 0,016 h−1 betrieben) mit CH4 als Energiequelle und CO2 als Kohlenstoffquelle (nicht angepasste Zellen; Abb. 1a), bis zu einer Belastung von 39 μmol CH4 min−1 · g DW−1 (Tabelle 1). Zum Vergleich wurde ein eigenes kontinuierliches Kultivierungssystem (mit identischer CH4-Belastung) entwickelt, um die Zellen an steigende H2S-Belastungen anzupassen (ergänzende Abbildung 1). Die in diesem Chemostat wachsenden Zellen oxidierten gleichzeitig H2S und CH4 (sulfidadaptierte Zellen; Abb. 1b), bis zu einer gleichzeitigen Belastung von 42 μmol H2S · min−1 · g DW−1 und von 38 μmol CH4 · min−1 · g DW−1 (Tabelle 1), während die H2S-Konzentration im Gasauslass unter 2 nmol · L−1 blieb. Kontinuierliche Steady-State-Kulturen nicht-adaptierter und sulfidadaptierter Zellen könnten über viele Generationen hinweg aufrechterhalten werden (Abb. 1a, b). Die Ansammlung von elementarem Schwefel (S0) über Wochen des Wachstums war offensichtlich, da sich zunehmende Mengen eines gelben Niederschlags (unregelmäßige mikroskopisch kleine Partikel) entwickelten und an den Metallteilen und Wänden des Chemostaten hafteten (ergänzende Abbildung 2). Nach einigen Wochen Betrieb mit H2S wurde festgestellt, dass es zu über 99 % aus reinem Schwefel bestand und dass diese Menge mindestens 80 % des in diesem Zeitraum umgewandelten Sulfids ausmachen könnte. Mithilfe der Mikroskopie konnten im Gegensatz zu Bakterienzellen nur winzige Mengen an Schwefelpartikeln in der Flüssigkeit beobachtet werden. Sowohl nicht adaptierte als auch sulfidadaptierte Kulturen wurden bei niedrigen Konzentrationen an gelöstem O2 (1 % Luftsättigung) betrieben, um die chemische Sulfidoxidation zu minimieren. Die niedrigen O2-Konzentrationen führten auch zur Expression der Hydrogenase-Aktivität, wie zuvor beobachtet41. Kontrollinkubationen in Experimenten mit Membraneinlass-Massenspektrometrie (MIMS) ohne Zellen zeigten eine vernachlässigbare Oxidation von Sulfid bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich.

eine kontinuierliche Kultur, die Methan oxidiert. b Kontinuierliche Kultur, die gleichzeitig hohe Konzentrationen von CH4 und H2S oxidiert. c Fed-Batch-Kultur, die einen Anstieg der 13C-Biomasse mit H2S als einziger Energiequelle zeigt. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichungen dargestellt (n = 3 technische Replikate). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Verrukomikrobielle Methanotrophe besitzen den Calvin-Benson-Bassham-Zyklus zur CO2-Fixierung42, was die Frage aufwirft, ob sie als Chemolithoautotrophe auf CO2 mit H2S als Energiequelle wachsen können. Dementsprechend wurde ein Fed-Batch-Reaktor mit einer verdünnten Kultur (OD600 = 0,05) des dualen H2S-CH4-Chemostaten beimpft und H2S und 13CO2 als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle ergänzt, während die CH4-Versorgung unterbrochen wurde. Im Laufe der Zeit wurde die Biomasse der SolV-Zellen von M. fumariolicum durch den Einbau von 13CO2 in die Biomasse mit Kohlenstoff-13 angereichert (Abb. 1c). Bei Erhöhung der H2S-Belastung stieg der Anteil der 13C-Biomasse entsprechend an. Das Wachstum war offensichtlich, da eine Zunahme der 13C-Biomasse mit einer Zunahme des Trockengewichts einherging (ergänzende Abbildung 3). Durch die Quantifizierung von H2S am Gaseinlass und -auslass des Reaktors wurden H2S-Umwandlungseffizienzen von ~98–100 % während der gesamten Inkubationszeit ermittelt.

Die H2S-Verbrauchsraten und die hemmende Wirkung von H2S auf M. fumariolicum SolV-Zellen wurden in einer mit Flüssigkeit gefüllten Kammer gemessen, die mit einem Membraneinlass-Massenspektrometer (MIMS) verbunden ist, das die gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Gase in Echtzeit und O2 ermöglicht wurde mit einem Sensorspot gemessen. Es wurde eine maximale CH4-Umwandlungsrate von nicht adaptierten Zellen von 200 ± 11 μmol CH4 · min−1 · g DW−1 bei einer gleichzeitigen O2-Verbrauchsrate von 302 ± 9 μmol O2 · min−1 · g DW−1 gemessen (Tabelle 1). Im Vergleich dazu wurde für die sulfidadaptierten Zellen eine maximale CH4-Umwandlungsrate und eine damit einhergehende O2-Verbrauchsrate von 33 bzw. 30 % niedriger gemessen. Ebenso waren die maximalen Methanol-Atmungsraten von sulfidadaptierten Zellen um 32 % niedriger als die der nicht adaptierten Zellen (Tabelle 1). Unter Berücksichtigung der 1 mol O2, die für die Aktivierung von 1 mol CH4 erforderlich sind, waren die maximalen CH4-Atmungsraten der nicht-adaptierten und Sulfid-adaptierten Zellen etwa dreifach niedriger im Vergleich zu den maximalen Methanol-Atmungsraten (Tabelle 1), was darauf hindeutet Umwandlung von Methan in Methanol als geschwindigkeitsbestimmender Schritt. Darüber hinaus zeigten die nicht adaptierten und sulfidadaptierten Zellen, vermutlich aufgrund der niedrigen dO2-Konzentration in den kontinuierlichen Kulturen, eine hohe Hydrogenaseaktivität (Tabelle 1), mit einem gemessenen H2:O2-Verbrauchsverhältnis von ~1:0,35, wie erwartet32. 42. Wie bei der CH4- und Methanol-Atmung waren die maximalen H2-Atmungsraten der sulfidadaptierten Zellen niedriger als die der nicht adaptierten Zellen (Tabelle 1). Daher geht der Gewinn an erhöhter H2S-Oxidationskapazität in sulfidadaptierten Zellen auf Kosten der CH4-, Methanol- und H2-Umwandlungskapazitäten.

Sulfidadaptierte Zellen im Chemostat oxidierten H2S auf niedrige, nicht hemmende Konzentrationen (Abb. 1b), was notwendig ist, da die CH4-Oxidationskapazität nichtadaptierter Zellen (sowie sulfidadaptierter Zellen) durch eine H2S-Konzentration beeinflusst wurde so niedrig wie 1 μM. Die CH4-Oxidation wurde in Gegenwart von 2 μM, 4–5 μM bzw. 10 μM H2S um etwa 25 %, 70–85 % bzw. 95 % gehemmt (Abb. 2). Die Hemmung der CH4-Umwandlung schien reversibel zu sein, denn wenn H2S verbraucht oder aus kurzfristigen Inkubationen ausgespült wurde, wurden die CH4-Umwandlung und die CO2-Produktion sofort mit ihren vorherigen Raten wieder aufgenommen. Nach längerer Hemmung durch 10–20 μM H2S (2 Stunden) waren die CH4-Umwandlungsraten um 25–35 % niedriger. Ob diese niedrigeren Raten das Ergebnis einer Hemmung von pMMO oder auch anderer Teile der Atmungskette waren, konnte nicht geschlussfolgert werden, da die Umwandlung von Methanol (CH3OH) nach solch langen H2S-Expositionen ebenfalls beeinträchtigt war.

H2S wurde durch impulsweise Zugabe von H2S zur MIMS-Kammer auf verschiedenen stabilen Konzentrationen (unten angegeben) gehalten. Die Zahlen geben die CH4-Verbrauchsraten in μmol CH4 · min−1 · g DW−1 an. Nach 170 Minuten ist die MIMS-Kammer anoxisch geworden, was zur Einstellung des CH4-Verbrauchs führt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wenn den nicht adaptierten Zellen in der MIMS-Kammer nur H2S verabreicht wurde, wurden hohe anfängliche O2-Verbrauchsraten gemessen. Interessanterweise sanken diese Raten innerhalb weniger Minuten sofort und schnell um das ~15-fache auf stabile Raten von 10 ± 1 μmol O2 · min−1 · g DW−1 (bei 40–80 μM H2S und <10 μM O2). Dieser schnelle Rückgang der Atemfrequenz deutete auf das Vorhandensein von sulfidempfindlichen terminalen Oxidasen (SSTOs) hin, die nach der Zugabe von H2S schnell inaktiviert wurden, und auf mindestens einen Typ von sulfidunempfindlichen terminalen Oxidasen (SITO), der für die weiterhin niedrige Atemfrequenz verantwortlich war43. Die maximale Reaktionsrate des SITO (10 ± 1 μmol O2 · min−1 · g DW−1) ist begrenzt, da sie nur 3 % der maximalen Atmungsrate dieser nicht adaptierten Zellen auf Methanol ausmacht (Tabelle 1). Bei 10-fach höheren O2-Konzentrationen (70–90 µM O2 und 30–80 µM H2S) erhöhte sich die verbleibende Atmungsrate um etwa 40 % (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass O2 mit H2S um das aktive Zentrum der SSTOs konkurriert Linderung der H2S-Hemmung. Die SITO-Aktivität war cyanidempfindlich, da 95 % der Atemfrequenz bei 1 mM Kaliumcyanid gehemmt wurde. Die sulfidadaptierten Zellen oxidierten H2S mit maximalen O2-Verbrauchsraten von 53 ± 4 μmol O2 · min−1 · g DW−1 (Tabelle 1). Da angenommen wurde, dass die SSTOs bei 40–80 μM H2S vollständig gehemmt sind, stellen diese Werte die Raten der SITO dar, die im Vergleich zu den nicht adaptierten Zellen mehr als fünfmal höher sind (Tabelle 1). H2S wird hauptsächlich in elementaren Schwefel (S0) umgewandelt, da nach gleichzeitiger Quantifizierung des H2S- und O2-Verbrauchs zusammen mit der sichtbaren Produktion von S0 eine H2S:O2-Stöchiometrie von 1:0,48 (± 0,005; n = 3) ermittelt wurde (ergänzende Abbildung). . 7b).

Maximale Umwandlungsraten von H2S bei nicht hemmenden, niedrigen (submikromolaren) Konzentrationen in der MIMS-Kammer waren aufgrund seines schnellen Verbrauchs, der zu einer variablen Hemmung führte, schwierig zu erreichen. Alternativ wurden die maximalen H2S-Umwandlungsraten im dualen H2S-CH4-Chemostat ermittelt, indem die Sulfidbelastung im Laufe eines Tages schrittweise auf 156 μmol H2S · min−1 · g DW−1 erhöht und gleichzeitig die Auslasskonzentration überwacht wurde (Tabelle 1). . Letzterer stieg von 2 auf 25 nmol · L−1 und blieb daher unter einer Flüssigkeitskonzentration von 40 nM, von der angenommen wurde, dass sie pMMO nicht beeinflusst (gemessen durch MIMS-Inkubationen). Dennoch ging die CH4-Umwandlung um etwa 40 % zurück, blieb aber tagelang stabil. Wenn dem Chemostat auf ähnliche Weise nur H2S zugeführt wurde, während CH4 abgeschaltet war, wurde die gleiche maximale H2S-Umwandlungsrate von 156 μmol H2S · min−1 · g DW−1 gemessen. Da die Atmung in diesem Aufbau nicht der limitierende Faktor ist (Tabelle 1), wird diese Rate als maximale H2S-Umwandlungsrate angesehen, die 1,5-mal höher ist als die SITO-Aktivität, die in diesen sulfidadaptierten Zellen berücksichtigt werden kann und durch die SSTOs ermöglicht wird wurden bei diesen niedrigen Sulfidkonzentrationen nur teilweise gehemmt. Ähnliche Raten wurden für sulfidadaptierte Zellen in der MIMS-Kammer in Gegenwart von 60–80 μM O2 gemessen (Tabelle 1). Daher weisen die Zellen bei niedrigen H2S- und/oder hohen O2-Konzentrationen die höchsten Sulfidumwandlungsraten auf, da die SSTOs nur teilweise gehemmt werden. Bemerkenswerterweise übertraf die oben gemessene maximale H2S-Umwandlungsrate in der MIMS-Kammer die maximale CH4-Umwandlungsrate der sulfidadaptierten Zellen (Tabelle 1).

Nach Zugabe von Methanol während der Atmung von 20–40 μM H2S durch nicht angepasste Zellen in der MIMS-Kammer hörte der H2S-Verbrauch sofort auf (Abb. 3a), aber die Gesamtatmungsrate stieg um ~40 %. Im Gegensatz dazu setzte sich die H2S-Oxidation durch sulfidadaptierte Zellen (mit fünfmal höherer SITO-Aktivität) mit 43 % der Rate fort, als Methanol zugegeben wurde (Abb. 3b), während die Gesamtatmungsrate um ~25 % anstieg (ergänzende Abb. 4). ). Daher wurden Methanol und H2S gleichzeitig eingeatmet und scheinen um die gleiche terminale Oxidase zu konkurrieren. Wenn den an Sulfid angepassten Zellen während der Methanolatmung Sulfid (30 µM) zugesetzt wurde, verringerte sich der O2-Verbrauch um das Dreifache (ergänzende Abbildung 5). Die verbleibenden Atmungsraten (66 μmol O2 · min−1 · g DW−1) waren höher als aufgrund der maximalen (SITO-abhängigen) H2S-Atmungsrate (53 ± 4 μmol O2 · min−1 · g DW−1) zu erwarten war. Dies deutet darauf hin, dass zumindest noch etwas Methanol eingeatmet wurde, was durch die Tatsache bestätigt wurde, dass die CO2-Produktionsrate in Gegenwart von Sulfid weiterhin bei 20–30 % lag. Im Gegensatz dazu war bei gleichen H2S-Konzentrationen die CH4-Atmung fast vollständig zum Erliegen gekommen (Abb. 2).

a Einstellung des H2S-Verbrauchs durch nicht adaptierte Zellen nach Zugabe von Methanol (Endkonzentration 0,4 mM). b Hemmung des H2S-Verbrauchs durch sulfidadaptierte Zellen nach Zugabe von Methanol (Endkonzentration 5 mM). Die Zahlen geben die Verbrauchsraten in μmol H2S · min−1 · g DW−1 an. Die schwarze horizontale Linie zeigt einen kurzen Moment der Anoxie an, um zu zeigen, dass die H2S-Oxidation von O2 abhängt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Zugabe von H2S zu nicht angepassten Zellen, die H2 verbrauchen, verringerte die H2-Verbrauchsrate um 30 %, während der H2S-Verbrauch erst nach vollständiger Erschöpfung von H2 einsetzte (Abb. 4). Darüber hinaus war die H2-Atmung bis zu doppelt so hoch wie die H2S-Atmung, nachdem alles H2 aufgebraucht war. In ähnlicher Weise wurde die H2S-Oxidation bei 20–40 μM H2S durch Zugabe von 200 μM Ameisensäure (CHOOH) um etwa 80 % reduziert (ergänzende Abbildung 6), während die Gesamtatmungsrate um 15 % anstieg. Die Beobachtung, dass H2S erst oxidiert wird, nachdem H2 (oder Methanol) aufgebraucht ist (Abb. 4), legt aufgrund ihrer begrenzten Atmungskapazität konkurrierende Elektronentransferwege zur sulfidunempfindlichen terminalen Oxidase (SITO) nahe. Interessanterweise wurde H2S unter anoxischen Bedingungen erzeugt, als in einem separaten Experiment 1,2 mM H2S als einzige Energiequelle über ~3 Stunden oxidiert wurden und die O2-Zugabe gestoppt wurde (ergänzende Abbildung 7). Es ist denkbar, dass der Stamm SolV ein Sulfid-produzierendes Enzym verwendet, das die zuvor produzierten Polysulfide und/oder elementaren Schwefel (S0) reduziert. Im Gegensatz dazu wurde H2 in Abwesenheit von Polysulfiden und/oder elementarem Schwefel unter anoxischen Bedingungen nicht verbraucht, was darauf hindeutet, dass diese Schwefelverbindungen und nicht das im Medium vorhandene Sulfat als Elektronenakzeptor verwendet wurden. Die H2S-Produktion wurde auf bis zu 13 μmol H2S · min−1 · g DW−1 stimuliert, wenn H2 oder Methanol als Elektronendonor vorhanden war.

Grüne Zahlen geben die H2-Verbrauchsraten in μmol · min−1 · g DW−1 vor bzw. nach der H2S-Zugabe an. Die rote Zahl und die Linie geben die H2S-Verbrauchsrate in μmol · min−1 · g DW−1 nach der H2-Verarmung an. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die H2S-Oxidationskinetik durch sulfidadaptierte Zellen wurde mit einem Gaschromatographen untersucht, der eine niedrigere Nachweisgrenze als das MIMS aufweist. Beginnend bei 3,5 μM H2S und 190 μM O2 wurde ein nahezu linearer Abfall bis auf 1 μM H2S mit einer Geschwindigkeit von 167–223 μmol H2S · min−1 · g DW−1 beobachtet (Abb. 5a). Diese Raten sind etwas höher als die maximalen H2S-Umwandlungsraten, die in der MIMS-Kammer bei 5–30 μM H2S und 60–80 μM O2 gemessen wurden (Tabelle 1), was durch die höheren O2- und niedrigen H2S-Konzentrationen in den verwendeten Inkubationen erklärt werden könnte für GC-Messungen. Da O2 und H2S um die sulfidempfindliche terminale Oxidase (SSTO) konkurrieren, mildern eine niedrige H2S- und eine hohe O2-Konzentration die SSTO-Hemmung, was zu höheren H2S-Verbrauchsraten führt. Die Michaelis-Menten-Modellierung des H2S-Verbrauchs ergab eine scheinbare Affinitätskonstante Ks von 0,32 μM H2S. Allerdings folgten die H2S-Spuren unter 1 μM H2S nicht der vorhergesagten Kurve und blieben leicht darüber (Abb. 5a). Als in der MIMS-Kammer der O2-Verbrauch bei H2S-Konzentrationen von 15–20 μM bis auf Null verfolgt wurde, wurde eine scheinbare Affinitätskonstante Ks von 0,14 ± 0,01 μM O2 ermittelt, die der Michaelis-Menten-Kinetik folgt (Abb. 5b). In Gegenwart von 15 μM H2S wurde SITO nicht gehemmt, da nach sequenzieller Zugabe von O2 identische O2-Verbrauchsraten gemessen wurden (ergänzende Abbildung 8). Unter der Annahme, dass unter diesen Bedingungen nur ein Typ der terminalen Oxidase aktiv ist und die H2S-Umwandlung nicht der limitierende Faktor ist, könnte ein Ks von 0,14 ± 0,01 μM O2 ein zuverlässiger Wert für die sulfidunempfindliche terminale Oxidase sein.

eine H2S-Oxidation, gemessen durch Gaschromatographie. Verschiedene blau schattierte Rauten stellen biologische Replikate dar (n = 3). Die Reaktion wurde durch Zugabe von Zellen nach 33 Minuten gestartet. b H2S-Atmung, gemessen durch einen faseroptischen Sauerstoffsensorpunkt in der MIMS-Kammer. Schwarze Linien zeigen die Michaelis-Menten-Kurvenanpassung an. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Zellen bei 0 Minuten gestartet. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu beurteilen, wie sich SolV-Zellen von M. fumariolicum an H2S anpassen, wurde mRNA aus dem dualen H2S-CH4-Chemostat (Sulfid-adaptierte Zellen) und dem CH4-Chemostat (nicht adaptierte Zellen), beide im Steady-State, extrahiert und die Genexpression quantifiziert ( Tabelle 2; Ergänzende Abbildung 9; Ergänzende Daten 1). In sulfidadaptierten Zellen war das Operon MFUM_v2_0219-21 etwa 1,7-fach hochreguliert. Die Gene in diesem Operon werden als NAD(FAD)-abhängige Dehydrogenase (MFUM_v2_0219), ein zum Schwefelträgerprotein TusA homologes Protein (MFUM_v2_0220) bzw. als mutmaßliches Schwefelträgerprotein DsrE2 (MFUM_v2_0221) bezeichnet. Eine detailliertere Untersuchung ergab, dass MFUM_v2_0219 eine Sulfid:Chinon-Oxidoreduktase (SQR) vom Typ III kodiert44. Basierend auf Genvergleichen könnte ein zweites Gen (MFUM_v2_0138) einen SQR kodieren, obwohl dieses Gen in Gegenwart von H2S nicht signifikant hochreguliert wurde und in sulfidadaptierten Zellen in viel geringerem Maße als MFUM_v2_0219 transkribiert wurde (Supplementary Data 1). Es wurden zwei Gene (MFUM_v2_0873 und MFUM_v2_1149) transkribiert, die möglicherweise Schwefeldioxygenasen kodieren, die mutmaßlich elementaren Schwefel zu Sulfit (SO32−) oxidieren könnten (Ergänzungsdaten 1). Darüber hinaus wurden die Gene MFUM_v2_0942 und MFUM_v2_0943 zwei- bzw. achtfach hochreguliert (Tabelle 2) und zeigen eine hohe Ähnlichkeit mit Genen, die für das Cytochrom-C-Protein SorB bzw. die Sulfit:Cytochrom-C-Oxidoreduktase SorA von Thiobacillus novellus kodieren45. In sulfidadaptierten Zellen wurde die mutmaßliche Schwefeldioxygenase (MFUM_v2_0873) in ähnlichem Maße wie SQR (MFUM_v2_0219) transkribiert. Basierend auf der in der MIMS-Kammer quantifizierten Stöchiometrie von 1 H2S: 0,48 O2 ( ± 0,005; n = 3) wird jedoch angenommen, dass die Umwandlung von elementarem Schwefel und Polysulfiden über Sulfit zu Sulfat unter den getesteten Bedingungen eine untergeordnete Rolle spielt. Darüber hinaus ging die Oxidation von H2S nie mit einem Abfall des pH-Werts einher, was der Fall gewesen wäre, wenn elementarer Schwefel weiter zu Thiosulfat, Sulfit oder Sulfat oxidiert worden wäre. Das Operon MFUM_v2_1257-61 kodiert für eine Cytochrom-C-Oxidase vom Ba3-Typ, die in Gegenwart von H2S um das Fünffache hochreguliert wurde, was mit der fünffach höheren SITO-Atmungsrate in sulfidadaptierten Zellen übereinstimmt. Interessanterweise kodiert das am stärksten hochregulierte Gen (15-fach) für ein 89 kDa großes Heptahaem-Cytochrom-C-Protein mit unbekannter Funktion (MFUM_v2_1950), das die größte Ähnlichkeit mit Genen aufweist, die in thermophilen Sulfid-Oxidationsmitteln gefunden werden. In Gegenwart von H2S wurden mehrere Gene, die für Enzyme kodieren, die an der Biosynthese von Sulfid zur Produktion schwefelhaltiger Metaboliten (z. B. Cystein, Methionin und Glutathion) beteiligt sind, stark herunterreguliert (Tabelle 2). Darüber hinaus wurde eine Herunterregulierung von Genen beobachtet, die an der CH4-Oxidation und dem anschließenden Elektronentransfer in der Atmungskette beteiligt sind (Tabelle 2). Diese Herunterregulierung steht im Einklang mit den gemessenen verringerten maximalen Methanumwandlungs- und Atmungsraten.

Die Beobachtung, dass M. fumariolicum SolV über einen SQR verfügt, und die Tatsache, dass CH4 und H2S in einer Vielzahl von Umgebungen koexistieren, veranlassten uns, das Vorhandensein von SQR in Methanotrophen zu untersuchen. Tatsächlich sind Gene, die mutmaßliche SQRs kodieren, auch in proteobakteriellen Methanotrophen verschiedener Umgebungen wie Seen, Feuchtgebieten, Rhizosphäre, Meeressedimenten, Permafrostböden, Reisfeldern, Kläranlagen, alkalischen Sodaseen, Deponien und Grundwasserleitern weit verbreitet (ergänzende Abbildung 10). . SQRs werden aufgrund ihrer Struktur in sechs verschiedene Typen eingeteilt und unterscheiden sich in ihrer Affinität zu H2S und ihrer physiologischen Rolle in der Zelle44. Mutmaßliche SQRs wurden in einer Vielzahl von proteobakteriellen Gattungen nachgewiesen, in denen ein pMMO und/oder sMMO vorhanden war, wie z. Methylospira, Methyloterricola, Methylotetracoccus, Methylotuvimicrobium und Methylovulum (Ergänzende Abbildung 10). Darüber hinaus kodiert der kürzlich isolierte Alphaproteobakterium-Stamm HY1 „Methylovirgula thiovorans“ für einen SQR40 vom Typ I. Im Gegensatz dazu besitzen verrukomikrobielle Methanotrophe Gene, die für einen Typ-III-SQR kodieren, der bakterielle und archaeale SQRs umfasst, von denen die wenigsten bekannt sind44.

In dieser Studie zeigen wir zum ersten Mal, dass ein Mikroorganismus CH4 und H2S gleichzeitig oxidieren kann und dass ein Methanotropher Biomasse aus CO2 mit H2S als einziger Energiequelle erzeugen kann. Wir haben gezeigt, dass die Oxidation von H2S notwendig ist, da H2S sowohl die Atmung als auch die CH4-Oxidation hemmt. Zellen reagierten auf das Vorhandensein von H2S mit der Hochregulierung einer Typ-III-Sulfid:Chinon-Oxidoreduktase (SQR) und einer sulfidunempfindlichen terminalen Oxidase vom Ba3-Typ (SITO). Darüber hinaus liefern wir Hinweise auf einen H2S-Entgiftungsmechanismus bei Methanotrophen, der laut genomischen Informationen und dem gleichzeitigen Vorkommen von Methan und Sulfid in einer Vielzahl von Umgebungen weit verbreitet zu sein scheint.

Über die Wirkung von H2S auf die Methantrophie ist sehr wenig bekannt. Ein methanotrophes Konsortium, das auf einer Mülldeponie Proben entnommen hatte, zeigte in Gegenwart von H2S46 eine verminderte methanotrophe Aktivität. Darüber hinaus ist die CH4-Oxidation durch Methylocaldum sp. SAD2, isoliert aus einem sulfidreichen anaeroben Fermenter, wurde in Gegenwart von 0,1 % H2S deutlich gehemmt (44–60 % Rückgang der Methanolproduktion), der Mechanismus wurde jedoch nicht erforscht47,48. Kürzlich wurde gezeigt, dass der „Methylovirgula thiovorans“-Stamm HY1A in der Lage ist, verschiedene reduzierte Schwefelverbindungen zusammen mit CH4 zu verbrauchen, eine gleichzeitige Oxidation von CH4 und H2S konnte jedoch nicht beobachtet werden40. In dem Torfland, aus dem der Stamm HY1A isoliert wurde, lag die H2S-Konzentration unter der Nachweisgrenze, was darauf hindeutet, dass eine kräftige H2S-Entgiftung möglicherweise nicht erforderlich ist. Im Gegensatz dazu sind die geothermischen Umgebungen, in denen sich M. fumariolicum SolV und andere verrukomikrobielle Methanotrophe befinden, durch hohe H2S-Konzentrationen (von <50 ppm bis 20.000 ppm) gekennzeichnet28,35,49. Dementsprechend könnte die nachgewiesene Fähigkeit, CO2 mit H2S als einziger Energiequelle zu fixieren und H2S effizient zu S0 zu oxidieren, in solch rauen Systemen von großem Vorteil sein. Wenn man bedenkt, dass in der natürlichen Umwelt mehrere Substrate nebeneinander existieren, dürfte ein mixotropher Lebensstil, bei dem CH4, H2 und H2S gleichzeitig genutzt werden, vorteilhafter sein32,50.

Es ist bekannt, dass H2S an Metalle wie Kupfer und Eisen bindet, was zu einer Hemmung der CH4-Oxidationskapazität des kupferabhängigen pMMO und der terminalen Oxidasen führen könnte, die an der Reduktion von O21,4,5,6,51,52 beteiligt sind. Interessanterweise kodiert der „Methylovirgula thiovorans“-Stamm HY1A nur ein eisenabhängiges sMMO40, wohingegen M. fumariolicum SolV drei kupferabhängige pMMOs kodiert16. Der erstere Stamm oxidiert H2S und CH4 nicht gleichzeitig, während der letztere über ein schnelles H2S-Entgiftungssystem verfügt, um die Hemmung der Methanotrophie zu mildern. Das Ausmaß, in dem eine Art Methanmonooxygenase durch H2S gehemmt wird, könnte daher die Notwendigkeit eines H2S-Entgiftungssystems beeinflussen. Da in M. fumariolicum SolV das Gen, das für einen SQR vom Typ III kodiert, in Gegenwart von H2S hochreguliert wurde, schlagen wir vor, dass dieses Enzym für die beobachtete Oxidation von H2S zu elementarem Schwefel verantwortlich ist. Tatsächlich wurde gezeigt, dass Typ-III-SQRs die Oxidation von H2S mit der Reduktion von Chinonen in mehreren Archaeen und Bakterien koppeln53,54. In verrukombiellen Methanotrophen kommen drei verschiedene Typen terminaler Oxidasen vor: ein aa3-Typ, ein ba3-Typ und ein cbb3-Typ16. Der Besitz mehrerer Arten terminaler Oxidasen ermöglicht eine verzweigte Elektronentransportkette, was in Umgebungen mit schwankenden Bedingungen und variierender Substrat- und Sauerstoffverfügbarkeit von großem Vorteil ist. Durch Atmungsstudien haben wir gezeigt, dass M. fumariolicum SolV eine oder mehrere sulfidempfindliche terminale Oxidasen (SSTO) und mindestens eine sulfidunempfindliche terminale Oxidase (SITO) besitzt. Da eine terminale Oxidase vom Ba3-Typ in Zellen, die unter hoher H2S-Belastung wachsen, stark hochreguliert ist, schlagen wir vor, dass dieser spezifische Enzymkomplex der dedizierte SITO in verrukomikrobiellem Methanotrophen ist. In ähnlicher Weise war diese ba3-Typ-Oxidase in schwefelgezüchteten Zellen von Acidithiobacillus ferrooxidans hochreguliert55. Das stark hochregulierte Heptahaem-Cytochrom-C-Protein (MFUM_v2_1950) in M. fumariolicum SolV könnte als Elektronenträger vom SQR zur Elektronentransportkette beteiligt sein. Dieser mutmaßliche Elektronenträger könnte erklären, warum die H2S-Atmung bei der Zugabe von Methanol in den Sulfid-adaptierten Zellen teilweise noch anhält, in den nicht-adaptierten Zellen jedoch nicht. Im letzteren Fall könnte das Fehlen dieses mutmaßlichen Heptahäm-Elektronenträgers der begrenzende Faktor für die H2S-Atmung sein, der durch die relativ großen Mengen des Elektronenträgers XoxGJ außer Kraft gesetzt wird, der den Elektronentransfer von Methanol zur terminalen Oxidase vermittelt56. Im Gegensatz dazu beträgt in nicht angepassten Zellen das Verhältnis in den Transkripten der Gene, die für XoxGJ und den mutmaßlichen Heptahaem-Elektronenträger kodieren, 27,6 im Vergleich zu 1,2 in sulfidadaptierten Zellen. Dementsprechend könnte die Hochregulierung des Gens, das für den Heptahaem-Elektronenträger kodiert, die Sulfidatmung gleichzeitig mit der Methanoloxidation unter Verwendung derselben terminalen Oxidase ermöglichen. H2S behindert sowohl die SSTO als auch die durch pMMO katalysierte Reaktion, da bei 10 μM H2S die Umwandlung von CH4 fast vollständig inaktiviert war, während die Umwandlung von Methanol, Formiat und H2 noch ablaufen konnte. Der beobachtete Rückgang der CH4-Umwandlung im Chemostat bei einer maximalen H2S-Belastung von 156 μmol H2S · min−1 · g DW−1 (Flüssigkeitskonzentration <40 nM) war größer, als aus unseren Studien zur Hemmung der Methanumwandlung zu erwarten war, und könnte darauf hindeuten Ein großer Teil der Atmungskette wird für die durch H2S-Oxidation erzeugten Elektronen verwendet, was zu einem überreduzierten Q-Pool führt, der die ordnungsgemäße Funktion des alternativen Komplexes III (ACIII) verhindert. Die Oxidation von H2S ist erforderlich, um dieses Molekül in niedrigen, nicht hemmenden Konzentrationen zu halten. Folglich müssen die bei dieser Oxidation freigesetzten Elektronen von der Elektronentransportkette verarbeitet werden, was zu einer Substratkonkurrenz bei der gleichzeitigen Oxidation mehrerer Verbindungen wie H2S und CH4 führt. Ebenso wurde vorgeschlagen, dass ein überaktiver SQR in Rhodobacter capsulatus zu einer übermäßigen Reduzierung des Chinonpools führen könnte57. Die hochregulierte Oxidase vom Ba3-Typ könnte dieses Problem lindern, indem sie Chinol oxidiert und den terminalen Elektronenakzeptor O2 reduziert. In Aquifex aeolicus wurde eine verwandte Oxidase vom ba3-Typ in einem Superkomplex mit SQR58 gefunden. Es wurde gezeigt, dass diese terminale Oxidase nicht nur reduziertes Cytochrom C, sondern auch Ubiquinol direkt oxidiert59. Im Stamm SolV könnte das stark hochregulierte Heptahaem-Protein eine wichtige Rolle als dedizierter Elektronenshuttle zwischen dem Chinon-akzeptierenden ACIII und der ba3-Typ-Oxidase spielen. Eine verzweigte Elektronentransportkette mit verschiedenen terminalen Oxidasen ermöglicht metabolische Vielseitigkeit und Anpassungen. Beispielsweise verwendet E. coli während des Wachstums die protonenpumpende Oxidase vom Bo3-Typ, benötigt jedoch die sulfidunempfindlichen Oxidasen vom Bd-Typ, um in Gegenwart von H2S60 weiter zu wachsen. Interessanterweise sind zwei Gene vorhanden, die Schwefeldioxygenasen (MFUM_v2_0873 und MFUM_v2_1149) kodieren könnten, um elementaren Schwefel weiter zu oxidieren. Die gemessene Stöchiometrie von 1 H2S zu 0,48 O2, die Produktion von elementarem Schwefel und das Fehlen einer Säureproduktion zeigen jedoch deutlich, dass H2S nicht in nennenswertem Umfang weiter oxidiert wird. Es muss noch untersucht werden, ob Methanotrophe H2S weiter zu Sulfit und Sulfat oxidieren können.

Es wurde gezeigt, dass Zellen von M. fumariolicum SolV H2S schnell mit einer niedrigen scheinbaren Affinitätskonstante (dh hoher Affinität) unter 1 μM H2S oxidieren. Die beobachteten kinetischen Werte sind nicht überraschend, da H2S bereits bei solch geringen Konzentrationen die Methantrophie hemmt. Durch Gaschromatographie konnte keine genaue scheinbare Affinitätskonstante für ganze Zellen bestimmt werden, da der H2S-Verbrauch nicht einer typischen Michaelis-Menten-Kurve folgte. Eine Einschränkung der Atmungskapazität für die H2S-Oxidation über etwa 1 μM könnte eine solche Abweichung erklären und könnte durch Reinigung von SQR behoben werden. Die Beobachtung, dass M. fumariolicum SolV elementaren Schwefel oder Polysulfide in Gegenwart von H2 oder Methanol zu H2S reduziert, ist faszinierend. Der auf Thiosulfat gezüchtete „Methylovirgula thiovorans“-Stamm HY1A produzierte zunehmend ein Enzym, das einem Protein ähnelt, von dem bekannt ist, dass es Sulfhydrogenase-Aktivität besitzt40. Interessanterweise bildet dieses Enzym Cluster mit der Gruppe 3b [NiFe]-Hydrogenase von M. fumariolicum SolV, von der man annimmt, dass sie an der Produktion von NAD(P)H für die CO2-Fixierung beteiligt ist50. Tatsächlich wird vermutet, dass diese Hydrogenasen Sulfhydrogenase-Aktivität aufweisen können, was ein Mechanismus zur Beseitigung reduzierender Äquivalente sein könnte61,62. Daher könnte die Gruppe 3b [NiFe]-Hydrogenase von M. fumariolicum SolV für die Umwandlung von S0 in H2S verantwortlich sein. Die Kultivierung in Chemostatika erwies sich wiederum als sehr wirksames Instrument zur Untersuchung des Metabolismus von Methanotrophen41,63. Durch die Anpassung war M. fumariolicum SolV in der Lage, H2S mit einer fünfmal höheren Geschwindigkeit zu atmen als nicht angepasste Zellen, vermutlich aufgrund der Hochregulierung von SQR und der terminalen Oxidase vom Ba3-Typ.

Verrukomikrobielle Methanotrophe, die in geothermischen Umgebungen gedeihen, verfügen über einen klaren Mechanismus, um mit H2S umzugehen. Dementsprechend könnten SQR und eine sulfidunempfindliche terminale Oxidase es diesen Methanotrophen ermöglichen, in H2S-reichen Umgebungen zu gedeihen. Tatsächlich zeigte die Pyrosequenzierung, dass Methylacidimicrobium-verwandte 16 S-rRNA-Gensequenzen in der Krone von Betonabwasserrohren, die reich an CH4 und H2S64 sind, reichlich vorhanden waren. Was proteobakterielle Methanotrophe betrifft, bedarf die Wirkung von H2S weiterer Untersuchungen. Da aerobe Methanotrophe in Umgebungen leben, in denen häufig H2S vorhanden ist, schlagen wir vor, dass der Mechanismus der H2S-Entgiftung bei Methanotrophen in verschiedenen Umgebungen weit verbreitet ist.

Das in dieser Studie verwendete Methylacidiphilum fumariolicum SolV wurde aus einem Schlammtopf der Solfatara in der Nähe von Neapel, Italien, isoliert28. Das Genom dieses Stammes ist öffentlich verfügbar und zugänglich bei Genoscope [https://mage.genoscope.cns.fr/microscope/mage/viewer.php?O_id=1176] sowie bei EMBL/NCBI (BioProject PRJEA85607; Zugang ERS14853105). Diese Umgebung ist durch große Sulfidemissionen, hohe Temperaturen und extrem niedrige pH-Werte gekennzeichnet. Das Wachstumsmedium bestand aus 0,2 mM MgCl2, 0,2 mM CaCl2, 1 mM Na2SO4, 2 mM K2SO4, 7,5 mM (NH4)2SO4 und 1 mM NaH2PO4 sowie Spurenelementen in Endkonzentrationen von 1 μM NiCl2, 1 μM CoCl2, 1 μM MoO4Na2 , 1 μM ZnSO4, 1 μM CeCl3, 5 μM MnCl2, 5 μM FeSO4, 10 μM CuSO4 und 40–50 μM Nitrilotriessigsäure (NTA). Die Zellen wurden wie zuvor beschrieben als methanlimitierte Dauerkultur bei 55 °C gezüchtet65, mit der Ausnahme, dass der pH-Wert auf 2,5–3,0 reguliert wurde, ein kleiner 400-ml-Chemostat mit Medium wie oben beschrieben verwendet wurde und kein H2 zugesetzt wurde. Die Sauerstoffkonzentration wurde auf 1 % Luftsättigung reguliert. Darüber hinaus wurde ein zweiter Chemostat unter ähnlichen Bedingungen betrieben, dem jedoch über einen zusätzlichen Gaseinlass H2S zugesetzt wurde (Ergänzende Abbildung 1). H2S wurde durch Mischen von 100 mM anoxischem Na2S und 210 mM HCl in einer 50-ml-Flasche mit einer peristaltischen Pumpe hergestellt. Durch diese Flasche wurde der Argon/CO2-Gasstrom (95 %/5 %, v/v) zum Reaktor geleitet. Um die maximale H2S-Umsatzrate des Chemostaten zu ermitteln, wurden die Zellen durch Regulierung der Peristaltikpumpe schrittweise höheren H2S-Konzentrationen ausgesetzt. Die H2S-Konzentrationen im Gaseinlass und Gasauslass wurden mittels Gaschromatographie bestimmt (beschrieben im Unterabschnitt: Batch-Inkubationen und Gaschromatographie). Da H2S über den Gaseinlass zugeführt wurde und daher in die flüssige Phase überführt werden muss, liegt die flüssige H2S-Konzentration nahe oder niedriger als ihre Gleichgewichtskonzentration, die bei 55 °C dem 1,6-fachen der Gaskonzentration entspricht (berechnet anhand der Ostwald-Methode). Koeffizient bei 55 °C)66. Um außerdem zu beobachten, ob M. fumariolicum SolV auf H2S als einziger Energiequelle wachsen kann, wurde eine Fed-Batch-Kultur im gleichen Aufbau wie das Chemostat-System betrieben. In diesem Fall wurde der Mediumfluss gestoppt und das Argon/CO2-Gas durch einen reinen Argon-Gasstrom ersetzt. Gleichzeitig wurden zusätzlich gleiche Mengen einer 13C-markierten Bicarbonatlösung (50 mM) und einer HCl-Lösung (100 mM) in die Sulfid-Mischflasche gegeben, wodurch eine 13C-CO2-Gaskonzentration von etwa 2 % entstand. 5-ml-Biomasseproben aus der Fed-Batch-Kultur wurden durch mehrtägige Zentrifugation gesammelt und die Pellets mit angesäuertem Wasser (pH 3) gewaschen. Anschließend wurden die Pellets in kleinen Mengen angesäuertem Wasser resuspendiert und die Proben anschließend in Blechbecher pipettiert und über Nacht bei 70 °C im Vakuum getrocknet. Der 13CO2-Einbau in die Biomasse wurde durch Messung des 13/12C-Verhältnisses mit einem Finnigan DeltaPlus-Isotopenverhältnis-Massenspektrometer (IR-MS) wie zuvor beschrieben42 bewertet.

Um gelöste Gase genau zu messen, wurde die Membraneinlass-Massenspektrometrie (MIMS) wie zuvor beschrieben65 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass eine 30-ml-MIMS-Kammer verwendet wurde. Alle Raten wurden bei 52 °C gemessen. Die eingeführte Sonde bestand aus einem Edelstahlrohr mit stumpfem Ende (Durchmesser 3 mm), das mit 4–16 Löchern von 1 mm Durchmesser perforiert war. Die Löcher wurden mit Silikonschläuchen abgedeckt (Silastic, 50VMQ Q7-4750 Dow Corning, geliefert von Freudenberg Medical über VWR International, 1,96 mm Außendurchmesser x 1,47 mm Innendurchmesser). Zur einfacheren Montage wurde der Silikonschlauch kurz in Hexan eingeweicht, wodurch das Silikon aufquillt. Das Metallteil wurde mit Isopropanol als Schmiermittel benetzt. Die Sonde war über ein 1/8- oder 1/16-Zoll-Edelstahlrohr direkt mit dem MS verbunden, das mit einem Emissionsstrom von 40 μA betrieben wurde. In die Kammer gegebenes Medium mit einem pH-Wert, der dem der Kultur (pH 2,5–3,0) entsprach, wurde zunächst mit 3 % CO2 in Argongas gespült. Anschließend wurde die Sauerstoffkonzentration durch Zugabe von reinem Sauerstoffgas oder Luft über die Kammer auf den gewünschten Wert eingestellt Kopfraum. Masse 15 und 16 sind beide dominante Massen für CH4 im Massenspektrometer, aber Masse 15 hat ein viel geringeres Hintergrundsignal als Masse 16 und wurde daher zur Messung von CH4 ausgewählt. Methan und Wasserstoff (Masse 2) wurden als Gas im Kopfraum oder im Falle einer Kalibrierung aus einer gesättigten Stammlösung zugegeben. Diese Stammlösungen wurden in einer geschlossenen Flasche mit Wasser bei Raumtemperatur und einem Kopfraum aus reinem Gas mit bekanntem Druck hergestellt. Für die Löslichkeit in Wasser wurden 1,47 mM bzw. 0,80 mM für Methan und Wasserstoff angenommen (bei 22 °C und 1 bar)66. Zur Messung der CO2-Produktionsraten wurden 13C-Bicarbonat und äquimolare Mengen Schwefelsäure nach Spülung mit Argon zugegeben. Auf diese Weise erfolgt die gleichzeitig stattfindende CO2-Fixierung hauptsächlich aus 13C-markiertem CO2 (Masse 45), was zu einer geringeren Beeinträchtigung der Messung der CO2-Produktion führt. Zu Beginn war der unmarkierte CO2-Gehalt (Masse 44) sehr gering und sein Anstieg spiegelte fast ausschließlich die CO2-Produktion aus unmarkiertem Methan oder Methanol wider.

Die Stöchiometrie der H2S-Oxidation wurde durch pulsweise Zugabe einer Sulfid-Stammlösung und O2 (als winzige Gasbläschen mit einer Spritze) bestimmt, um die Konzentrationen bei 1–20 μM H2S und 0–5 μM O2 niedrig zu halten. Insgesamt wurden über einen Zeitraum von 1,5–3 Stunden 0,7–1,4 mM Na2S zugegeben. Während dieses Experiments wurden gleichzeitig äquimolare Mengen einer 200 mM Schwefelsäure-Stammlösung zugegeben, um die pH-Änderung auf 0,2 Einheiten zu begrenzen. Gleichzeitig wurde die Sauerstoffkonzentration in der MIMS-Kammer mithilfe eines faseroptischen Sauerstoffsensorflecks (TROXSP5, PyroScience, Aachen, Deutschland) gemessen, der auf der Innenseite der Kammer aufgeklebt war. Diese Punkte könnten bis zu etwa 20 nM Sauerstoff messen, was viel weniger ist, als mit dem Massen-32-Signal von MIMS gemessen werden kann.

Um die kinetischen Parameter der H2S-Oxidation durch sulfidadaptierte Zellen zu bestimmen, wurden Batch-Inkubationen in 120-ml-Serumflaschen mit 10 ml Medium ohne Spurenelemente durchgeführt. Auf Spurenelemente wurde verzichtet, um den Effekt der abiotischen Sulfidoxidation zu minimieren. Die Flaschen wurden mit Butylkautschukstopfen verschlossen. Die Inkubationen wurden bei 55 °C und 350 U/min durchgeführt. H2S wurde durch Mischen von Na2S mit HCl in einer geschlossenen Flasche hergestellt. Ein Headspace-Volumen wurde entnommen und in 120-ml-Serumflaschen injiziert und 30 Minuten lang äquilibriert, bevor der Test durch Zugabe von Zellen gestartet wurde. H2S wurde gemessen, indem 100 μl des Kopfraums der Flaschen mit einer Hamilton-Glasspritze in einen GC (7890B GC-Systeme, Agilent Technologies, Santa Clara, USA) injiziert wurden, der mit einer Carbopack BHT100-Glassäule (2 m, ID 2 mm) und einem ausgestattet war Flammenphotometrischer Detektor (FPD). Die erhaltenen Flächen wurden zur Berechnung der H2S-Mengen anhand von Kalibrierstandardkurven mit H2S verwendet. Kurz gesagt, 400 μl einer 25 mM Na2S-Stammlösung (Natriumsulfid-Nonahydrat, Reinheit >98 %, Sigma-Aldrich) wurden mit 2 ml 0,5 M HCl in einer 574-ml-Flasche angesäuert, wodurch eine Headspace-Konzentration von 17,4 nmol · ml−1 entstand. Anschließend wurden kleine Mengen des Kopfraums in eine 1162-ml-Flasche gegeben, um verschiedene H2S-Konzentrationen zu erzeugen, die zur Kalibrierung in den GC injiziert wurden (0,1 ml). Die Kalibrierungskurve reichte von ~1 nmol · L−1 bis 1 μmol · L−1 H2S.

Für jedes Replikat wurden 10 ml aus dem Chemostat entnommen und die Zellen wurden sofort 3 Minuten lang bei 15.000 × g pelletiert, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert. Die Zellen wurden aus Kulturen im stationären Zustand geerntet, was konstanten Parametern über mindestens 5 Änderungen des Reaktorvolumens entspricht. Die Gesamt-RNA wurde mit dem RiboPure™ RNA Purification Kit für Bakterien (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Ribosomale RNA wurde aus den gesamten RNA-Proben entfernt, um sie mit dem MICROBExpress™ Bacterial mRNA Enrichment Kit (Thermo Fisher Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers an mRNA anzureichern. Für die quantitative und qualitative Analyse der extrahierten Gesamt-RNA und angereicherten mRNA wurden das Qubit™ RNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) und das Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland) sowie Protokolle verwendet. Letzteres wurde zur Bibliotheksvorbereitung unter Verwendung des TruSeq Stranded mRNA Reference Guide (Illumina, San Diego, CA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet. Zur quantitativen und qualitativen Bewertung der synthetisierten cDNA wurden das Qubit™ dsDNA HS Kit (Thermo Fisher Scientific) und das Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies) sowie Protokolle verwendet. Transkriptom-Reads wurden mit FastQC67 auf Qualität überprüft und anschließend 10 Basenpaare am 5'-Ende und 5 Basenpaare am 3'-Ende jedes Reads gekürzt. Die Lesevorgänge wurden anhand des vollständigen SolV-Genoms von M. fumariolicum (Zugangsnummer LM997411)68 unter Verwendung von Bowtie269 kartiert. Der Rest der Analyse und die Erstellung der Bilder wurde in Version 4.0.2 der R-Umgebung70 durchgeführt. Die kartierten Lesezahlen pro Gen wurden mit Rsubread71 bestimmt und die Faltungsänderung und -dispersion wurden mit DEseq272 geschätzt. Bevor Statistiken erstellt wurden, wurde eine Hauptkomponentenanalyse der 1000 wichtigsten Gene nach Varianz jeder Probe durchgeführt, um zu überprüfen, ob Proben innerhalb derselben Erkrankung sowohl jedem Probenteil derselben Erkrankung ähnlich als auch keiner anderen Probe unähnlich waren. Für die differenzielle Expression wurde von DEseq2 ein Wald-Test verwendet, um angepasste p-Werte zu berechnen. Unterschiede in der Anzahl wurden als signifikant angesehen, wenn der Basismittelwert > 4 war, die log2-fache Änderung höher als [0,58] war und der angepasste p-Wert ≤ 0,05 war. Für einfache Vergleiche zwischen Proben wurden TPM-Werte (Transcripts Per Kilobase Million) berechnet.

Die Konzentrationen des gesamten organischen Kohlenstoffs (TOC) der Kulturen wurden mit einem TOC-L CPH/CPN-Analysator (Shimadzu, Duisburg, Deutschland) bestimmt. Die Proben wurden vor den Messungen dreimal in Milli-Q-Wasser verdünnt und anschließend 20 Minuten lang unter Rühren mit Ozon besprüht, um CO2 aus der Flüssigkeit zu entfernen. Aufgrund des niedrigen pH-Werts der Proben war eine Ansäuerung der Lösungen nicht erforderlich. Eine optische Dichte von 1, gemessen bei 600 nm, entspricht etwa 450 mg Trockengewicht (DW) pro Liter.

Alle verfügbaren Genomsequenzen bekannter Methylotrophen aus den Ordnungen Methylococcales (Gammaproteobacteria) und Methylacidiphilales (Verrucomicrobia), den Familien Methylocystaceae und Beijerinckia (Alphaproteobacteria) sowie der Gattung Methylomirabilis wurden aus der NCBI-Datenbank abgerufen. Genome von Methanotrophen wurden durch Sprengen von Aminosäuresequenzen von PmoA aus Methylococcus capsulatus (SwissProt-Zugang Q607G3) und sMMO aus Methylosinus acidophilus (NCBI-Zugang AAY83388.1) mit einem E-Wert-Schwellenwert von 10−3 und einem %-id-Schwellenwert von > ausgewählt 30 %. Anschließend wurden Genome, die eine Methanmonooxygenase-Sequenz enthielten, auf mutmaßliche SQR-Sequenzen durchsucht, indem eine repräsentative Sequenz jedes der SQR-Subtypen, wie in früheren Untersuchungen definiert, gesprengt wurde44: Typ I, WP_010961392.1; Typ II, WP_011001489.1; Typ III, WP_009059890.1; Typ IV, WP_011372252.1; Typ V, WP_012502121.1; Typ VI, WP_011439951.1. Mutmaßliche SQR-Sequenzen wurden mit denen im phylogenetischen Baum von44 unter Verwendung von Muscle 3.8.155173 mit Standardeinstellungen abgeglichen. Ein phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit und 500 Bootstrap-Replikaten wurde mit RAxML 8.2.1074 unter Verwendung der Rapid Bootstrapping-Option und dem LG-Aminosäuresubstitutionsmodell erstellt75. Der endgültige Baum wurde mit MEGA7 visualisiert und die Gruppe der Flavocytochrom-c-Sulfiddehydrogenase (FCSD)-Sequenzen wurde als Außengruppe verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die RNA-Sequenzierungsdaten dieser Studie wurden in der NCBI-Datenbank unter der Zugangsnummer PRJNA766544 hinterlegt. Das Genom von Methylacidiphilum fumariolicum SolV wurde in der NCBI-Datenbank unter der Zugangsnummer ERS14853105 hinterlegt. Ergänzende Daten 1 und die Quelldatendatei sind auch auf figshare verfügbar (https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22779005). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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RAS, SSM, TB und HJMOdC wurden vom Europäischen Forschungsrat (ERC Advanced Grant-Projekt VOLCANO 669371) unterstützt, MSMJ wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC Advanced Grant-Projekt EcoMoM 339880) unterstützt, WV wurde von der niederländischen Organisation für Wissenschaft unterstützt Forschungsstipendium (NWO) VI.Vidi.192.001 und SHP wurde durch das Stipendium ALWOP.308 der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO) unterstützt. Wir möchten Dr. Marianne Guiral und Dr. Frauke Baymann (CNRS, Universität Aix-Marseille, Marseille, Frankreich) für die fruchtbaren Diskussionen danken. Das LABGeM (CEA/Genoscope & CNRS UMR8030), die nationalen Infrastrukturen France Génomique und French Bioinformatics Institute (finanziert im Rahmen des von der Agence Nationale pour la Recherche verwalteten Investissement d'Avenir-Programms, Verträge ANR-10-INBS-09 und ANR-11 -INBS-0013) werden für die Unterstützung innerhalb der MicroScope-Annotationsplattform gedankt.

Rob A. Schmitz

Aktuelle Adresse: Institut für Biogeochemie und Schadstoffdynamik, Departement Umweltsystemwissenschaften, ETH Zürich, 8092, Zürich, Schweiz

Abteilung für Mikrobiologie, Radboud-Institut für Bio- und Umweltwissenschaften, Radboud-Universität, Heyendaalseweg 135, 6525AJ, Nijmegen, Niederlande

Rob A. Schmitz, Stijn H. Peeters, Sepehr S. Mohammadi, Tom Berben, Timo van Erven, Carmen A. Iosif, Theo van Alen, Wouter Versantvoort, Mike SM Jetten, Huub JM Op den Camp & Arjan Pol

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RAS, SSM, AP und HJMOdC haben das Projekt und die Experimente entworfen. RAS, SSM, TvE, CAI, TvA, WV und AP führten die Experimente durch. TB führte phylogenetische Analysen durch. RAS, SHP, SSM, TvE, CAI und AP führten Datenanalysen durch. RAS, MSMJ, HJMOdC und AP haben das Manuskript geschrieben. RAS, MSMJ, HJMOdC und AP überwachten die Forschung.

Korrespondenz mit Huub JM Op den Camp.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Christiane Dahl und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schmitz, RA, Peeters, SH, Mohammadi, SS et al. Gleichzeitige Sulfid- und Methanoxidation durch ein Extremophil. Nat Commun 14, 2974 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38699-9

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Eingegangen: 4. Januar 2023

Angenommen: 11. Mai 2023

Veröffentlicht: 23. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38699-9

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