Rationales Design ultrastabiler und reversibel photoschaltbarer fluoreszierender Proteine für Super

Scientific Reports Band 6, Artikelnummer: 18459 (2016) Diesen Artikel zitieren

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Phototransformierbare fluoreszierende Proteine sind für mehrere Nanoskopieansätze von zentraler Bedeutung. Bisher gibt es jedoch keine verfügbare Variante, die hochauflösende Bildgebung in Zellkompartimenten ermöglicht, die oxidative Bedingungen aufrechterhalten. Hier berichten wir über das rationale Design von zwei reversibel schaltbaren fluoreszierenden Proteinen, die sich im bakteriellen Periplasma falten und photoschalten lassen, rsFolder und rsFolder2. rsFolder wurde durch Hybridisierung von Superfolder-GFP mit rsEGFP2 entwickelt und erbte die schnellen Falteigenschaften des ersteren zusammen mit dem schnellen Umschalten des letzteren, jedoch auf Kosten eines verringerten Umschaltkontrasts. Die strukturelle Charakterisierung der Schaltmechanismen von rsFolder und rsEGFP2 ergab unterschiedliche Szenarien für die cis-trans-Isomerisierung des Chromophors und ermöglichte die Entwicklung von rsFolder2, einer Variante von rsFolder, die einen verbesserten Schaltkontrast aufweist und für die RESOLFT-Nanoskopie geeignet ist. Die rsFolders können effizient im E. coli-Periplasma exprimiert werden, was die Tür zur nanoskaligen Untersuchung von Proteinen öffnet, die in bisher nicht beobachtbaren Zellkompartimenten lokalisiert sind.

Die nanoskalige Visualisierung intrazellulärer Details in lebenden Zellen durch hochauflösende Mikroskopie beruht häufig auf der Verwendung „phototransformierbarer“ fluoreszierender Proteine (PTFPs) als genetisch kodierte Marker1. Dementsprechend hat die Entwicklung von PTFPs mit verbesserten biochemischen oder photophysikalischen Eigenschaften die Entwicklung einer Vielzahl von Nanoskopieansätzen gefördert2,3. Insbesondere Methoden wie RESOLFT (REversible Saturable OpticaL Fluoreszenz Transitions)4, nichtlineare SIM (Structured Illumination Microscopy)5 oder pcSOFI (photochromic Stochastic Optical Fluctuation Imaging)6 nutzen reversibel schaltbare fluoreszierende Proteine (RSFPs), die wiederholt zwischen einer Fluoreszenz umschalten können („an“) und einen nicht fluoreszierenden („aus“) Zustand. In sogenannten „negativ schaltenden“ grünen RSFPs konkurriert der Ein-Aus-Übergang mit der Fluoreszenzemission bei Beleuchtung mit Cyan-Licht (~490 nm), während der Aus-Ein-Übergang sofort auf die Beleuchtung mit violettem Licht reagiert (~ 405 nm). Die negative RSFP-Unterfamilie bestand zunächst aus Dronpa7 und seinen Varianten8,9 und wurde nach und nach mit anderen Proteinen Anthozoen-Ursprungs (Korallen und Anemonen) wie rsCherryRev10, rsTagRFP11, den mGeos12 und den biphotochromen IrisFP13 und NijiFP14 angereichert. Die Entwicklung der RESOLFT-Nanoskopie in lebenden Zellen erfordert jedoch RSFPs, die auch bei geringer Beleuchtungsleistung effizient schalten (um Lichtschäden zu minimieren), im ausgeschalteten Zustand eine minimale Restfluoreszenz aufweisen (um den Kontrast zu maximieren) und äußerst widerstandsfähig gegen Schaltermüdung sind (um eine große Anzahl aufeinanderfolgender Ein-Aus-Schaltzyklen aushalten). Es wurde festgestellt, dass Varianten, die aus fluoreszierenden Proteinen hydrozoischen Ursprungs (Quallen) und insbesondere aus dem bekannten EGFP hergestellt wurden, diese Anforderungen erfüllen könnten, was zu rsEGFP15 und rsEGFP216 führte. Erst kürzlich wurde über durch gerichtete Evolution erhaltene Varianten von rsEGFP berichtet, die im Zytosol von Säugetierzellen reifen und effizienter exprimieren17. Es wurden auch RSFPs Anthozoen-Ursprungs mit verbesserten Photoschalteigenschaften eingeführt, darunter der positive Schalter Kohinoor18, der aus Padron8 hervorgegangen ist, und der negative Schalter Skylan-S, der aus mEos3.119 hervorgegangen ist.

Trotz der intensiven Entwicklung von PTFPs sind einige zelluläre Substrukturen im Nanomaßstab noch wenig erforscht, insbesondere Kompartimente, in denen oxidative Faltung stattfindet, wie das Peroxisom, das endoplasmatische Retikulum, der mitochondriale Intermembranraum oder das bakterielle Periplasma. Diese Kompartimente beherbergen jedoch eine große Anzahl wichtiger Makromoleküle, die beispielsweise an der Arzneimittelaufnahme, der Energieproduktion oder dem oxidativen Stoffwechsel beteiligt sind. Der Hauptgrund für diese Lücke im Bereich der Superauflösung liegt darin, dass fluoreszierende Proteine in stark oxidativen Umgebungen im Allgemeinen nicht in der Lage sind, sich richtig zu falten und Licht zu emittieren20. Die Entwicklung eines PTFP, das zur oxidativen Faltung fähig ist, ist daher erforderlich, um die hochauflösende Abbildung solcher Kompartimente in lebenden Zellen zu ermöglichen.

Das Periplasma gramnegativer Bakterien, manchmal auch als Eingangshalle der Zelle bezeichnet und macht 20–40 % ihres Gesamtvolumens aus21, ist an wichtigen Prozessen wie Zellteilung, Umweltsignalisierung und Zelltransport beteiligt22. Dementsprechend beherbergt es eine Vielzahl von Proteinen, die an der antibiotischen Wirkung (z. B. Penicillin-bindende Proteine) und der Resistenz (z. B. Beta-Lactamasen, Porine und Effluxpumpenkomponenten) beteiligt sind23,24. Das Verständnis der molekularen Prozesse, die im Periplasma ablaufen, ist daher sowohl von grundlegendem als auch von biomedizinischem Interesse. Vier Arten von Proteinen sind im Periplasma einer oxidativen Faltung ausgesetzt: sekretierte Proteine, periplasmatische Proteine, Proteine der inneren Membran und Proteine der äußeren Membran. Die meisten sekretierten und periplasmatischen Proteine der Außenmembran werden auf posttranslationale Weise exportiert, im Allgemeinen im entfalteten Zustand über den Sec-Sekretionsweg und seltener im gefalteten Zustand über den Twin-Arginin-Translocon (Tat)-Sekretionsweg25,26. Proteine der inneren Membran werden auf kotranslationale Weise eingefügt, nachdem die entstehende Polypeptidkette, die aus dem Ribosom austritt, durch das bakterielle Signalerkennungspartikel (SRP) erkannt und der dreiteilige Komplex an den in die Membran eingebetteten SRP-Rezeptor gebunden wird27. Es wurde gezeigt, dass das SRP- und Sec-System kooperativ agieren kann, um die korrekte Insertion von Membranproteinen sicherzustellen, die erhebliche hydrophile periplasmatische Domänen beherbergen28. Außerdem werden einige periplasmatische Proteine über den SRP-Weg transloziert. Obwohl nach der Translokation durch Tat22 eine periplasmatische GFP-Fluoreszenz beobachtet werden konnte, hat sich gezeigt, dass die GFP-Rückfaltung nach der Translokation durch Sec innerhalb des Periplasmas aufgrund der unerwünschten intermolekularen Disulfidbrückenbildung in der oxidativen Umgebung problematisch ist20. Obwohl diese GFP-Aggregate nicht fluoreszieren, zeigten sie eine starke Zytotoxizität29. Im Gegensatz dazu wurde gezeigt, dass Superfolder-GFP20,22,30,31, eine GFP-Variante, die für eine schnelle Reifung und Faltungskinetik entwickelt wurde, periplasmatische Proteinlokalisierungsstudien nach Sec-vermitteltem Transport ermöglicht, insbesondere wenn der SRP-Weg verwendet wurde30. Allerdings ist Superfolder-GFP nicht fototransformierbar und daher für hochauflösende Bildgebung ungeeignet.

Hier berichten wir über das rationale, strukturbasierte Design von zwei neuartigen superfaltenden RSFPs, rsFolder und rsFolder2. Beide RSFPs sind in der Lage, sich im bakteriellen Periplasma zu falten und effizient zu photoschalten, was die Tür für die nanoskopische Live-Bildgebung von Makromolekülen in solchen „feindlichen“ Kompartimenten öffnet. Konkret zeigen wir hier, dass rsFolder2 für die RESOLFT-Bildgebung des bakteriellen Periplasmas geeignet ist.

Wir kamen zu dem Schluss, dass Superfolder-GFP und rsEGFP2, die GFP als gemeinsamen „Vorfahren“ haben, durch rein rationales Design hybridisiert werden könnten, um eine reversibel schaltbare Variante bereitzustellen, die in der oxidativen Umgebung des E. coli-Periplasmas eine effiziente Faltung ermöglicht. Die vier Punktmutationen, die die Entwicklung von EGFP zu rsEGFP2 (T65A, Q69L, V163S, A206K)16 ermöglichten, wurden daher in Superfolder-GFP konstruiert und ergaben ein neues PTFP, das wir rsFolder nannten. Die T65A-Mutation, von der bekannt ist, dass sie rsEGFP216 Photoschaltfähigkeiten verleiht, zielt auf das Superfolder-GFP-Chromophor selbst ab. Zwei der drei anderen Mutationen zielen auf Aminosäurepositionen (163 und 206), die im Superfolder-GFP im Vergleich zum GFP-Vorfahren bereits modifiziert wurden (siehe Sequenzausrichtung in der ergänzenden Abbildung S1). Wir haben uns entschieden, diese rsEGFP2-Mutationen im rsFolder beizubehalten, da festgestellt wurde, dass ein Serin an Position 163 entscheidend ist, um den Schaltkontrast in rsEGFP216 zu verstärken, während ein Lysin an Position 206, das dem Lösungsmittel zugewandt ist, den GFP-Varianten einen starken Monomercharakter verleiht32. Somit weist rsFolder im Vergleich zu rsEGFP2 sechs Punktmutationen auf (S31R, N40Y, S100F, T106N, Y146F und M154T), von denen nur eine in der Nähe des Chromophors auftritt (Y146F) (Abb. S1, Abb. S2b).

Die photophysikalischen Eigenschaften von rsFolder und rsEGFP2 sind sehr ähnlich (Tabelle 1, Abb. 1 und Abb. S3). Als rsEGFP2 ist rsFolder ein effizienter negativer Photoschalter, sowohl in gereinigter Form (Abb. 1a) als auch in lebenden Zellen (Abb. S4). Die beiden Proteine weisen nahezu identische Absorptions- und Fluoreszenzspektraleigenschaften auf (Abb. 1b, c). Der pKa des rsFolder-Chromophors (pKa = 5,5) ist etwas niedriger als der von rsEGFP2 (pKa = 5,9) (Abb. S5, Tabelle 1). Beide RSFPs reifen langsamer als Superfolder-GFP (~40 Minuten), mit entsprechenden Halbwertszeiten von ~2,5 Stunden (rsFolder) und ~3 Stunden (rsEGFP2) (Abb. 1d, Tabelle 1). rsFolder ist ebenfalls monomer (Abb. S6, Tabelle S1) und faltet sich genauso schnell wie Superfolder-GFP (Abb. 1e). Photophysikalische und biochemische Daten legen daher nahe, dass rsFolder sowohl die schnellen Faltungseigenschaften von Superfolder-GFP als auch die schnellen Schalteigenschaften von rsEGFP2 geerbt hat. Darüber hinaus bleibt seine Fluoreszenzemission über einen weiten pH-Bereich erhalten (Abb. S7).

Spektroskopische und biochemische Eigenschaften.

Superfolder-GFP (orange), rsEGFP2 (lila), rsFolder (cyan) und rsFolder2 (navy). (a) Schaltzyklus bei geringer Beleuchtungsintensität (488 nm: 1,9 mW/cm2, 405 nm: 2,2 mW/cm2). rsFolder schaltet sich schneller aus als rsEGFP2, erreicht aber im ausgeschalteten Zustand eine höhere Restfluoreszenz (Einschub). In Bezug auf Schaltgeschwindigkeit und Kontrast verhält sich rsFolder2 ähnlich wie rsEGFP2. Das scheinbare Restschalten ist ausschließlich auf die direkte Fluoreszenzanregung durch den 405-nm-Laser zurückzuführen. (b,c) Anregungs- und Emissionsspektren von rsFolder (b, Cyan) und rsFolder2 (c, Marine) im Vergleich zu denen von rsEGFP2 (lila). (d) Die Chromophor-Reifungskinetik zeigt, dass die Chromophore von rsEGFP2, rsFolder und rsFolder2 (Ala-Tyr-Gly) mit ähnlichen Geschwindigkeiten reifen, während das von Superfolder-GFP (Thr-Tyr-Gly) schneller reift. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung bei Dreifachmessungen dar. (e) Fluoreszenzwiederherstellungskinetik während der Rückfaltung nach chaotroper Denaturierung durch Guanidinhydrochlorid. Das Fluoreszenzsignal wurde kontinuierlich bei 25 °C überwacht. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung bei Dreifachmessungen dar. (f) Thermische Entspannung der photogeschalteten Aus-Zustände, gefolgt von der maximalen Absorption im Ein-Zustand für rsEGFP2 (lila), rsFolder (Cyan) und rsFolder2 (Marineblau). Werte finden Sie in Tabelle 1.

rsFolder weist jedoch seine eigenen Besonderheiten auf. Erstens ist die thermische Stabilität im ausgeschalteten Zustand (~64 Stunden) 15-mal höher als die von rsEGFP2 (Abb. 1f und Tabelle 1) und unseres Wissens beispiellos unter RSFPs. Außerdem weist rsFolder nach dem Ausschalten ein höheres Maß an Restfluoreszenz auf als rsEGFP2, was zu einem verringerten Schaltkontrast führt (Abb. 1a, Abb. S4 und Tabelle 1). Dieses Merkmal ergibt sich aus der erhöhten Off-to-On-Quantenausbeute und dem höheren Extinktionskoeffizienten des Off-Zustands bei 488 nm (Tabelle 1, Abb. S3), der die RESOLFT-Bildgebung voraussichtlich beeinträchtigen wird. Eine mögliche Erklärung für diese Unterschiede ist, dass die beiden RSFPs über unterschiedliche Mechanismen photoschalten. Um diese Hypothese weiter zu untermauern, sind Erkenntnisse auf molekularer Ebene erforderlich.

Mit Ausnahme von Dreiklang33 wurde vorgeschlagen, dass alle RSFPs hydrozoischen Ursprungs beim Ausschalten eine cis-trans-Isomerisierung ihres Chromophors durchlaufen, analog zu RSFPs anthozoischen Ursprungs34. Diese Hypothese wurde kürzlich durch Strukturstudien an der rsGreen0.7-Variante von rsEGFP17 bestätigt. Es bleibt jedoch unklar, ob rsEGFP2 und rsFolder über denselben Mechanismus photoschalten oder nicht. Die Untersuchung der Absorptionsspektren von rsEGFP216 und rsFolder im ausgeschalteten Zustand zeigt eine breite Bande mit der Mitte bei ~400 nm. Dies deutet stark darauf hin, dass in beiden Proteinen die klassische Regel gilt – das heißt, die Protonierung des Chromophors geht mit der Isomerisierung einher. Um die Schaltmechanismen von rsFolder und rsEGFP2 aufzuklären, haben wir ihre kristallographischen Strukturen sowohl im Ein- als auch im Aus-Zustand gelöst (Abb. 2 und Tabelle 2). Das Ein-Aus-Schalten wurde durch die Beleuchtung von Kristallen mit einem fasergekoppelten 488-nm-Laser ausgelöst. Die Modelle wurden mit einer Auflösung von 1,45 Å (Ein-Zustand) und 1,50 Å (Aus-Zustand) für rsEGFP2 bzw. mit einer Auflösung von 1,50 Å (Ein-Zustand) und 2,35 Å (Aus-Zustand) für rsFolder verfeinert. Die experimentellen Fourier-Differenzkarten liefern Hinweise darauf, dass das Ausschalten in beiden RSFPs tatsächlich auf die cis-trans-Isomerisierung des Chromophors zurückzuführen ist (Abb. S8). Unsere Strukturen zeigen jedoch große Unterschiede zwischen den Photoschaltmechanismen von rsEGFP2, rsFolder und Dronpa, dem Anthozoen-RSFP-Archetyp . Bei Dronpa und anderen negativen RSFPs wie mTFP0.736 oder IrisFP13 wird beim Umschalten eine drastische strukturelle Reorganisation der Chromophorumgebung beobachtet. Die eng wasserstoffgebundene Glu144-His193-Glu211-Triade in der cis-Konformation wird durch die Glu144-Arg66-Glu211-Triade in der trans-Konformation ersetzt, wobei entweder His193 oder Arg66 den Chromophor durch π-Stapelung und Kation-π-Wechselwirkungen mit dem p stabilisieren -Hydroxybenzyliden-Einheit34. Im Gegensatz dazu wird in rsEGFP2 und rsFolder keine solche Reorganisation von H-Brückennetzwerken beobachtet und die strukturellen Veränderungen sind auf die nahe Umgebung des Chromophorphenolats beschränkt (Abb. 2 und Abb. S8).

Kristallstrukturen von rsEGFP2 und rsFolder im Ein- und Ausschaltzustand.

Für rsEGFP2 (a) und rsFolder (b) werden verfeinerte Modelle der Chromophore und umgebenden Reste gezeigt. Anfängliche Ein-Zustände werden mit farbigen Kohlenstoffatomen angezeigt (Violett und Cyan für rsEGFP2 bzw. rsFolder). Aus-Zustände werden mit grauen Kohlenstoffen angezeigt. Die bei ±4,5 σ konturierten Fobs(off)-Fobs(on)-Differenzelektronendichtekarten (gelb: negativ; blau: positiv) heben Atome hervor, die eine bemerkenswerte Bewegung vom fluoreszierenden Zustand (cis-Konformation) zum photogeschalteten Zustand (trans-Konformation) zeigen. . H-Brücken (2,7–2,9 Å) sind mit gestrichelten Linien dargestellt.

Bei den Anthozoen-negativen RSFPs wurde auch festgestellt, dass die freie Energie des trans-Zustands durch die Fähigkeit von Ser142, einen anderen H-Bindungspartner zu finden, verringert wird, das eine starke H-Bindung mit der Hydroxybenzyliden-Einheit im cis-Zustand aufrechterhält Chromophor-Isomerisierung35,37. Eine ähnliche Situation wird in rsEGFP2 beobachtet, wo His149, das die gleiche Rolle wie Ser142 in Dronpa spielt (Abstand zum Chromophorphenolat: 2,7 Å), Tyr146 als Ersatz-H-Brückenpartner im trans-Zustand des Chromophors findet. Dieser Photoschaltmechanismus ist identisch mit dem kürzlich für rsGreen0.717 berichteten. Bemerkenswert ist, dass in diesen drei RSFPs das Phenolat des Off-State-Chromophors alle H-Bindungen zum Barrel-Gerüst verliert und nur noch an ein strukturelles Wassermolekül H-gebunden ist, das bisher in der On-State-Struktur fehlte (Abb. 2a). . Ein völlig anderes Szenario ist jedoch in rsFolder zu beobachten, wo Tyr146 durch ein hydrophobes Phenylalanin ersetzt wird, eine der von Superfolder-GFP geerbten Mutationen. Folglich ist das von rsFolder angezeigte Umschaltmuster einzigartig. Im eingeschalteten Zustand ist der Phenolatsauerstoff des cis-Chromophors über eine Wasserstoffbrücke an Thr204, ein Wassermolekül und His149 gebunden. Bei der Isomerisierung gehen die Wechselwirkungen mit den beiden ersten Partnern verloren, während His149 und der Phenolatsauerstoff H-gebunden bleiben, was zu einer trans-Konformation des Chromophors führt, die ein Spiegelbild der cis-Konformation ist (Abb. 2b). Dieser äußerst ungewöhnliche Mechanismus führt dazu, dass das Chromophor von rsFolder im ausgeschalteten Zustand fest mit dem Fassgerüst verbunden bleibt, was wahrscheinlich seine außergewöhnliche thermische Stabilität erklärt. Die begrenzte Anzahl von Resten, die am Ein-Aus-Umschalten von rsFolder beteiligt sind, und die damit einhergehende reduzierte Kaskade der Bildung und Zerstörung von Wasserstoffbrücken könnten zu einer höheren Energiebarriere für den Aus-Ein-Übergang in rsFolder als in rsEGFP2 führen.

Die kristallographischen Strukturen von rsEGFP2 und rsFolder in ihren Ein- und Aus-Zuständen liefern eine klare molekulare Grundlage für die beobachtete höhere thermische Stabilität des Aus-Zustands von rsFolder. Der verringerte Umschaltkontrast von rsFolder ist strukturell schwieriger zu erklären. Die einzigartige Symmetrie, die zwischen dem Ein- und Ausschaltzustand von rsFolder beobachtet wurde, könnte möglicherweise eine Rolle spielen. Strukturdaten zeigen auch die zentrale Rolle der Aminosäure an Position 146 bei der Differenzierung der Schaltmechanismen der beiden RSFPs und legen eine einfache Strategie nahe, den Mechanismus von rsFolder rational zu dem von rsEGFP2 weiterzuentwickeln – das heißt, Phe146 durch ein Tyrosin zu ersetzen . Daher wurde die F146Y-Mutante von rsFolder, bezeichnet als rsFolder2, hergestellt und charakterisiert. Wie erwartet weist rsFolder2 im Vergleich zu rsFolder (Abb. 1f) einen höheren Schaltkontrast (Abb. 1a, Abb. S4) und eine verringerte thermische Stabilität für den ausgeschalteten Zustand auf, wodurch sein photophysikalisches Verhalten dem von rsEGFP2 sehr nahe kommt. Gleichzeitig bleiben die von Superfolder-GFP geerbten Reifungs- (Abb. 1d) und Rückfaltungskinetiken im Wesentlichen in rsFolder2 erhalten (Abb. 1d, e). Insgesamt legen diese Eigenschaften (Umschaltkontrast, Photoresistenz, Reifung und Faltung) nahe, dass rsFolder2 ein geeigneter Kandidat für die nanoskalige Abbildung des bakteriellen Periplasmas mithilfe der RESOLFT-Mikroskopie sein könnte.

Nachdem wir festgestellt hatten, dass rsFolder und rsFolder2 sowohl schnell schaltende als auch gegen Lichtermüdung resistente RSFPs sind und dass sie sich in vitro genauso gut wie Superfolder-GFP zurückfalten, fragten wir, ob sie sich im zellulären Kontext falten und fotoschalten können, d. h. wenn sie in ausgedrückt werden Cytosol (pET15-b-Vektor) oder das Periplasma (pET26-b(+)-Vektor, Sec-Weg) von E. coli-Zellen. Die Helligkeit der Bakterienzellen, hier ausgedrückt als Verhältnis zwischen dem Fluoreszenzsignal (bei 505 nm) und der optischen Dichte (bei 600 nm), gibt Aufschluss über die Gesamtmenge der in lebenden Zellen vorhandenen gefalteten FPs. Im Vergleich zur zytosolischen Expression zeigten alle Klone in periplasmatischen Expressionstests eine geringere Helligkeit der Bakterienzellen, wobei der dramatischste Effekt bei Zellen beobachtet wurde, die rsEGFP2 exprimierten (Abb. S9a). Abbildung 3 zeigt, dass Kulturen, die rsEGFP2 im Periplasma exprimieren, vorzeitig absterben, vermutlich aufgrund der Akkumulation und Ablagerung ungefalteter Proteine in toxischen Aggregaten. Im Gegensatz dazu hat die periplasmatische Expression von rsFolder und rsFolder2 keinen Einfluss auf die Lebensfähigkeit der Zellen (Abb. 3a). Die verringerte Helligkeit von Zellen, die periplasmatische rsFolder und rsFolder2 exprimieren, ist wahrscheinlich auf das von Natur aus kleinere Volumen des Periplasmas und seine regulierte Gesamtproteinbelastung zurückzuführen. Um diese Hypothese zu überprüfen, trennten wir den periplasmatischen und zytosolischen Inhalt der Zellen und bewerteten die in jedem Kompartiment vorhandene Menge an RSFP durch Fluorimetrie und Gelelektrophorese (Abb. S9b). Die Ergebnisse stützen die Hypothese, dass die Proteinmenge, die an das Periplasma adressiert werden kann, tatsächlich begrenzt ist. Im Übrigen bestätigen sie auch, dass die beobachtete Fluoreszenz größtenteils (~70 %) von periplasmatischen RSFPs stammt. Wichtig ist, dass Schaltexperimente, die an auf festem Medium gezüchteten Zellen durchgeführt wurden, bestätigen, dass die Schalteffizienzen von rsFolder und rsFolder2 im zellulären Kontext erhalten bleiben (Abb. 3b und Abb. S4). Die Daten zeigen auch, dass die Photofatigue-Resistenz ähnlich ist, wenn die RSFPs an das Periplasma gerichtet sind.

Zytoplasmatische und periplasmatische Ausdrücke und Wechselmüdigkeit.

(a) Das Bakterienwachstum einer einzelnen Kolonie im Autoinduktionsmedium und weitere zytoplasmatische und periplasmatische Expressionen von rsFolder, rsFolder2 und rsEGFP2 wurden 20 Stunden lang in Absorption (rot) bzw. Fluoreszenz (schwarz) überwacht. Fehlerbalken stellen Standardabweichungen über dreifache Messungen dar. Die auf das Periplasma gerichtete Produktion von rsEGFP2 entspricht einem brutalen Stopp des Bakterienwachstums, der durch Zelltoxizität durch periplasmatische Verstopfung erklärt werden kann. (b) Switching-Ermüdungsmessungen von rsFolder und rsFolder2 im Vergleich zu rsEGFP2, exprimiert im Zytoplasma sowie im Periplasma lebender E. coli-Zellen. Die schwarzen Punkte zeigen die maximale Fluoreszenz im eingeschalteten Zustand jedes Schaltzyklus an. Die entsprechenden angepassten exponentiellen Abklingkurven werden in Rot angezeigt. Die gestrichelten Linien veranschaulichen die Anzahl der Zyklen, die die verschiedenen RSFP-Proben erreichen können, bevor sie auf die Hälfte ihrer ursprünglichen Fluoreszenz gebleicht werden.

Wir wollen ermitteln, ob rsFolder und rsFolder2 für die Bildbearbeitung verwendet werden können. Zuerst haben wir Zellen, die rsEGFP2, rsFolder oder rsFolder2 exprimieren, entweder im Zytosol oder im Periplasma durch Weitfeldbildgebung abgebildet (Abb. 4a). Zellen, die die RSFPs im Zytosol exprimieren, zeigen eine homogene Fluoreszenzverteilung, wohingegen auf Bildern von Zellen, die periplasmatischen rsFolder oder rsFolder2 exprimieren, klar abgegrenzte Periplasmen sichtbar sind. Es überrascht nicht, dass Zellen, die periplasmatisches rsEGFP2 exprimieren, ein kaum nachweisbares Signal und keine Abgrenzung des Periplasmas zeigen.

Weitfeld- und RESOLFT-Bildgebung.

(a) Repräsentative Weitfeldbilder von fixierten E. coli-Bakterien, die rsEGFP2, rsFolder und rsFolder2 entweder im Zytoplasma oder im Periplasma exprimieren. Alle Bilder wurden unter denselben Beleuchtungsbedingungen aufgenommen und auf denselben Dynamikbereich skaliert. Maßstab: 2 μm. (b) RESOLFT-Bildgebung lebender E. coli-Bakterien, die rsFolder2 im Periplasma exprimieren, und entsprechende beugungsbegrenzte konfokale Bilder. (c) Die Diagramme I-IV veranschaulichen Linienprofile über das Periplasma an den durch Pfeile in (b) gekennzeichneten Stellen. Jedes Profil besteht im Durchschnitt aus fünf benachbarten Linien mit einem Abstand von 30 nm. Maßstab: 1 μm

Anschließend führten wir eine RESOLFT-Mikroskopie an E. coli-Zellen durch, die periplasmatisches rsFolder2 exprimierten. Aus Messungen der engsten Regionen haben wir eine Auflösung von ~70 nm für das Periplasma abgeleitet (Abb. 4b, Liniendiagramm I). Einige Bakterien zeigten heterogene Strukturen, möglicherweise aufgrund der Anwesenheit von Peptidoglycan und zugehörigen Proteinen im periplasmatischen Raum (Abb. 4b, Liniendiagramme II-III). Wir konnten auch das Periplasma zweier benachbarter Bakterien unterscheiden, die nur 110 nm voneinander entfernt waren (Abb. 4b, Liniendiagramm IV), was eine deutliche Verbesserung der Auflösung im Vergleich zur beugungsbegrenzten Bildgebung zeigte. Eine ähnliche Auflösung (80 nm) wurde bei Kontrollen erzielt, bei denen eine Fusion von rsFolder2 mit Keratin18 im Zytosol von HeLa-Zellen exprimiert wurde, um deren RESOLFT-Leistung zu messen (Abb. S10)15,16. Die RESOLFT-Aufnahmen zeigen, dass die Dicke des Periplasmas zwischen den Zellen stark variiert (Abb. 4b). Wir korrelieren diese Beobachtung mit elektronenmikroskopischen Aufnahmen, die zeigen, dass das Periplasma in isolierten Zellen im Allgemeinen größer ist (bis zu Hunderte von Nanometern) als in Koloniezellen (einige Dutzend Nanometer) (Abb. S11a). Die heterogene Beschaffenheit des Periplasmas und die durch rsFolder2 ermöglichte Verbesserung der Auflösung werden weiter durch die Visualisierung möglicher Knospungsereignisse und Vesikelbildung in der Außenmembran in den RESOLFT-Bildern belegt (angezeigt durch Pfeile in Abb. S11b, c)38. Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen die gleichen Merkmale (Abb. S11b). Somit öffnen unsere Ergebnisse insgesamt die Tür zur hochauflösenden Live-Fluoreszenzbildgebung komplexer periplasmatischer und äußerer Membranprozesse, die bisher nur durch Elektronenmikroskopie verfolgt werden konnten.

Die rsFolders sind die beiden ersten RSFPs, die über oxidative Faltfähigkeiten verfügen. Wir haben gezeigt, dass beide in der Lage sind, sich im bakteriellen Periplasma zu falten und zu photoschalten, und dass rsFolder2 verwendet werden kann, um RESOLFT-Subbeugungsbilder zu erhalten. Es muss noch ermittelt werden, ob die rsFolders in anderen prokaryotischen oder eukaryotischen Zellkompartimenten verwendet werden können, in denen eine oxidative Faltung stattfindet, einschließlich des endoplasmatischen Retikulums, der Thylakoidmembranen, des mitochondrialen Intermembranraums und des externen Mediums39. Trotz seiner geringeren Helligkeit weist der Mutant rsFolder2 der zweiten Generation im Vergleich zu rsFolder einen verbesserten Schaltkontrast auf, was ihn zu einem gut geeigneten Kandidaten für RESOLFT macht. Wir gehen davon aus, dass diese Variante auch für andere Techniken wie die nichtlineare strukturierte Aktivierung SIM40 oder pcSOFI6 zur Abbildung periplasmatischer Proteine in lebenden Zellen nützlich sein könnte. rsFolder ist nicht für RESOLFT-Bildgebung geeignet, kann sich jedoch für andere hochauflösende Ansätze wie pcSOFI oder potenzielle Methoden, die von seiner extremen Stabilität im ausgeschalteten Zustand profitieren, als nützlich erweisen. Eine weitere Feinabstimmung der photophysikalischen Eigenschaften des rsFolders-Gerüsts ist denkbar, um es besser an andere hochauflösende Techniken anzupassen. Beispielsweise könnten langsam schaltende und/oder rotverschobene rsFolder-Varianten für die Lokalisierungsmikroskopie einzelner Moleküle und/oder die Mehrfarbenbildgebung entwickelt werden. Speziell für die RESOLFT-Bildgebung könnte rsFolder2 weiterentwickelt werden, um die erreichbare Auflösung entweder rational oder durch gezielte Evolution zu erhöhen. Ob solche Verbesserungen möglich sind oder nicht, wird künftige Forschung zeigen.

E. coli DH5α-Zellen wurden zur Klonierung und DNA-Amplifikation verwendet, während E. coli BL21 (DE3) zur Expression verwendet wurde. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Bakterienkulturen in LB-Medium gezüchtet, das mit 100 μg/ml Ampicillin (zytoplasmatischer rsFolder, rsFolder2 und rsEGFP2) oder 30 μg/ml Kanamycin (zytoplasmatischer Superfolder-GFP und periplasmatischer rsFolder, rsFolder2 und rsEGFP2) ergänzt war. Die Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich bezogen.

Die Plasmide Superfolder-GFP/pET-30 und rsEGFP2/pQE31 wurden freundlicherweise von Dr. Cécile Morlot bzw. Prof. Stefan Jakobs zur Verfügung gestellt. rsFolder wurde basierend auf der Struktur von Superfolder-GFP entwickelt, indem in die Sequenz die vier Schlüsselmutationen von rsEGFP2 im Vergleich zu EGFP (T65A, Q69L, A163S und V206K) eingeführt wurden. Die von Eurofins MWG Operon synthetisierte Sequenz wurde sowohl für die menschliche als auch für die E. coli-Expression rekursiv codonoptimiert und eine Kozak-Sequenz wurde für eine mögliche Expression in Säugetierzellen eingefügt. Die häufigsten Restriktionsstellen wurden aus der resultierenden Kodierungssequenz entfernt, um weitere Klonierungsanwendungen zu erleichtern. rsFolder2 wurde durch gerichtete Mutagenese unter Verwendung der rsFolder-Vorlage erhalten und ist eine Einzelpunktmutante von rsFolder (F146Y). Für zytosolische Expressionstests wurden rsEGFP2, rsFolder und rsFolder2 in pET-15b (zwischen NdeI- und BamHI-Restriktionsstellen) subkloniert. Für periplasmatische Expressionstests wurden die Proteine mithilfe der Gibson-Assemblierungsmethode41 in pET-26b(+) subkloniert. Plasmid-DNA und PCR-Fragmente wurden mit einem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) bzw. einem Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen) gereinigt. Das für das Keratin18-rsFolder2-Fusionsprotein kodierende Plasmid wurde durch Ersetzen der kodierenden Sequenz von TagRFP durch die von rsFolder2 (Restriktionsstellen: KpnI und NotI) im kommerziellen pTagRFP-Keratin-Vektor (Evrogen, Moskau, Russland) erzeugt.

Fluoreszierende Proteine, die an einen N-terminalen Polyhistidin-Tag fusioniert waren, wurden in E. coli BL21 (DE3)-Zellen exprimiert. Nach der Zelllyse wurden die fluoreszierenden Proteine durch Ni-NTA-Affinitätschromatographie und anschließende Größenausschlusschromatographie unter Verwendung einer HiLoad 16/600 Superdex 75-Säule (GE Healthcare, Freiburg, Deutschland) gereinigt. Gereinigte Proteine wurden durch Ultrafiltration konzentriert und in Pufferlösungen (50 mM HEPES pH 7,5) äquilibriert. Kristalle von rsEGFP2 und rsFolder wurden durch die Dampfdiffusionsmethode mit hängendem Tropfen bei 20 °C erhalten. Kurz gesagt, das Protein (12 mg/ml für rsEGFP2 und 10 mg/ml für rsFolder) und die Fällungsmittellösung (0,1 M HEPES pH 8,1, 1,7 M Ammoniumsulfat für rsEGFP2 und 0,1 M Tris pH 8,5, 20 % PEG 3.350 für rsFolder). 1:1 gemischt, was 2-μl-Tropfen ergab, die über eine 1-ml-Vertiefung mit der Fällungsmittellösung gegeben wurden. Kristalle erschienen innerhalb von 1–7 Tagen.

Vor der Datenerfassung wurden Kristalle von rsEGFP2 und rsFolder im Ein-Zustand durch kurzes Einweichen in der mit 15 % Glycerin ergänzten Mutterlauge kryogeschützt und anschließend in flüssigem Stickstoff abgekühlt. Um die Aus-Zustände zu erzeugen, wurden die Kristalle nach dem Kryoschutz und vor der Blitzkühlung in flüssigem Stickstoff etwa 1 Minute lang mit einem fasergekoppelten 488-nm-Laser beleuchtet. Röntgenbeugungsdatensätze wurden bei 100 K an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) an den Strahllinien ID23-242 (rsEGFP2) und ID2943 (rsFolder) gesammelt, ausgestattet mit einem PILATUS 2M bzw. einem PILATUS 6M Detektor. Die Daten wurden mit XDS/XSCALE verarbeitet, zusammengeführt und skaliert und Amplitudenfaktoren wurden mit XDSCONV44 generiert. Die Strukturen wurden durch die Methode des molekularen Ersatzes in Phasen unterteilt, wobei als Ausgangsmodell die Röntgenstruktur von Superfolder-GFP (PDB-ID: 2B3P) und das Programm PHASER45 verwendet wurden. Der Modellbau wurde mit Coot46 durchgeführt. Nach jeder Phase des manuellen Umbaus folgten eine Energieminimierung und eine individuelle B-Faktor-Verfeinerung. Verfeinerung und Kartenberechnungen wurden mit REFMAC47 und PHENIX48 durchgeführt. Statistiken zur Datenerfassung und -verfeinerung sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die Zahlen wurden mit PyMOL49 erstellt.

Sedimentationsgeschwindigkeitsexperimente wurden in einer analytischen XL-I-Ultrazentrifuge (Beckman Coulter, USA) mit einer Rotorgeschwindigkeit von 42.000 U/min bei 20 °C und unter Verwendung eines AnTi-50-Rotors durchgeführt. Je nach Konzentration wurden Proben von 55, 110 oder 420 μl jeweils in Ti-Doppelsektor-Mittelstücke mit einer Pfadlänge von 1,5, 3 oder 12 mm geladen, die mit Saphirfenstern ausgestattet waren (Nanolytics GmbH, Deutschland). Das Lösungsmittel und die Referenzpuffer waren 50 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM NaCl. Radiale Scans bei 280, 488 oder 395 nm und von Interferenzoptiken wurden überwacht. Die Daten wurden mit Standardmethoden verarbeitet, die in der Sedfit-Software v14.6e (www.analyticalultracentrifugation.com) zur Datenanalyse implementiert sind. Pufferparameter (insbesondere der Sedimentationskoeffizient bei 20 °C, s20w) wurden mit dem Programm Sednterp (sednterp.unh.edu) und unter der Annahme einer Dichte (ρ) und einer Viskosität (η) von 1,008 g.ml−1 berechnet 1,05 mPa.s. Sedimentationsgeschwindigkeitsprofile wurden sowohl im Hinblick auf die kontinuierliche Verteilung c(s) der Sedimentationskoeffizienten (s)50 als auch im Rahmen des Modells der nicht interagierenden Arten analysiert und lieferten experimentelle Werte für s und Konzentration einerseits und die Molmasse M, auf der anderen Seite. Das vorhergesagte partielle spezifische Volumen- und Brechungsindexinkrement (∂n/∂c) betrug 0,733 ml.g−1 und 0,189 für rsFolder und 0,735 ml.g−1 und 0,190 für rsEGFP2, was darauf hinweist, dass die beiden Proteine als Monomere sedimentieren. Die Zahlen wurden mit Gussi v1.0.9e (biophysics.swmed.edu/MBR/software.html) erstellt.

Absorptionsspektren wurden mit einem UV/VIS-Fotospektrometer Jasco V-630 (Easton, USA) aufgezeichnet. Anregungs- (λem = 540 nm) und Emissionsspektren (λex = 480 nm) sowie Rückfaltungs-, Reifungs- und Expressionskinetik wurden mit einem Biotek Synergy H4-Mikroplattenlesegerät (Winooski, VT, USA) aufgezeichnet. Emissionsspektren wurden durch Anregung bei 480 nm erhalten, während Anregungsspektren durch Messung der Fluoreszenz bei 540 nm erhalten wurden. Die molaren Extinktionskoeffizienten wurden mit der Ward-Methode51 bestimmt. Die Fluoreszenzquantenausbeuten wurden relativ zu Fluorescein (ΦFL = 0,95) berechnet und unter Verwendung der von Williams et al.52 beschriebenen Methode zwischen Proteinen kreuzvalidiert. Die pKa-Werte wurden durch Messung des anionischen Absorptionspeaks der verschiedenen FPs als Funktion des pH-Werts bestimmt verschiedene Puffer [Zitronensäure (pH 3,5), Natriumacetat (4,0–5,0), MES (5,5–6,5), HEPES (7,0–8,5), CHES (9,0–9,5)]. Die thermische Stabilität der ausgeschalteten RSFPs wurde durch Überwachung der Absorption als Funktion der Zeit alle 10 Minuten über einen Zeitraum von 1 bis 5 Tagen gemessen. Die fotoinduzierte Fluoreszenzwiederherstellung ausgeschalteter FPs wurde bei 20 °C mit einem CCD-basierten Spektrometer (AvaSpec-ULS2048, Avantes, Eerbeek, Niederlande) gemessen, das mit optischen Fasern an einen Küvettenhalter gekoppelt war. Verdünnte Proteine (50 μl) wurden in eine 50 μl-Küvette mit drei Fenstern gegeben und ein quadratischer Diffusor (Thorlabs, ED1-S50) wurde vor die Küvette gestellt, um homogene Laseranregungen bei 488 nm (1,9 mW/cm2) sicherzustellen 405 nm (2,2 mW/cm2). Die Fluoreszenzemission wurde alle 2 s gemessen (λem = 506 ± 4 nm für rsEGFP2, rsFolder und rsFolder2; λem = 512 ± 4 nm für Superfolder-GFP).

Eine konstante Beleuchtung bei 488 nm diente sowohl dazu, die Proteine auszuschalten als auch ihre Fluoreszenz anzuregen, während alle 600 Sekunden 150 Sekunden lang eine abwechselnde Beleuchtung bei 405 nm verwendet wurde, um die Erholung von Aus zu An zu fördern. Die Entwicklung des Fluoreszenzsignals wurde dann mit MATLAB (The MathWorks Inc., Natick, Massachusetts, USA) im Rahmen der von Duan et al.53 beschriebenen Methode analysiert, was eine genaue Berechnung der Schaltquantenausbeuten ermöglichte.

Alle Proteine wurden in einem Denaturierungspuffer (8 M Guanidinhydrochlorid, 1 mM DTT, 50 mM HEPES pH 7,5) auf 0,1 mg/ml verdünnt und 10 Minuten lang auf 65 °C erhitzt. Überraschenderweise reichte eine Behandlung mit konzentriertem Harnstoff ohne Erhitzen nicht aus, um diese fluoreszierenden Proteine richtig zu entfalten. Denaturierte Proteine wurden dann 10-fach in einem Renaturierungspuffer (35 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 50 mM Tris pH 7,5, 30 % Glycerin) verdünnt. Für jedes Protein wurde die Rückfaltungskinetik gemessen, indem die Fluoreszenzwiederherstellung bei 25 °C verfolgt wurde (λem = 485 ± 9 nm für alle Proteine; λem = 505 ± 9 nm für rsFolder, rsFolder2 und rsEGFP2 und bei λem = 510 ± 9 nm für Superfolder). -GFP) jede Minute während 20 Minuten. Datenpunkte wurden entlang der Zeit t mit der Funktion mit k, der Rückfaltungsrate, angepasst; tm, die mittlere Rückfaltungszeit; und der abgeleitete Verzögerungsparameter, der durch erhalten wird. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Die Reifungskinetik wurde unter Verwendung eines von Moore et al. angepassten Protokolls gemessen.54 Kurz gesagt wurden 50 ml Bakterienkulturen in LB-Medium in 250-ml-Kolben bis zu einer optischen Dichte von 0,6 gezüchtet und dann in versiegelte 50-ml-Röhrchen überführt. Dadurch konnte eine anaerobe Umgebung geschaffen werden, die die Proteinexpression ermöglicht, aber die Zellteilung und die Reifung der Chromophore stoppt. Die Proteine wurden nach IPTG-Induktion (1 mM) über Nacht bei Raumtemperatur exprimiert. Bei 4 °C wurden die Zellen dann durch Zentrifugation geerntet, in 5 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,5 mM, 1 Tablette Anti-Protease-Cocktail, ergänzt mit DNAseI) resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung lysiert. Nach der Zentrifugation wurden 50 μl Überstand zu 200 μl Reoxygenierungspuffer (35 mM KCl, 2 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl pH 7,5) gegeben. Die Fluoreszenzintensitäten wurden bei 37 °C alle 10 Minuten über einen Zeitraum von ca. 8 Stunden aufgezeichnet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Um einen synchronisierten Start der Proteinexpression sicherzustellen und zu gewährleisten, dass zu Beginn des Experiments keine nachweisbare Absorption oder Fluoreszenz vorhanden war, wurden Bakterien für diese Expressionstests in einem autoinduzierbaren Medium gezüchtet. Kurz gesagt, für jeden Klon wurde eine einzelne Bakterienkolonie verwendet, um 5 ml Autoinduktions-Wachstumsmedium55 bei 25 °C zu inokulieren und dann auf Platten mit 96 Vertiefungen mit 100 μl pro Vertiefung zu verteilen. Bakterien wurden unter Verwendung von Glukose als Kohlenstoffquelle gezüchtet, bis eine OD von 0,6 erreicht war (~8 Stunden). Anschließend wurde die Proteinexpression durch Umstellung auf Laktose als Kohlenstoffquelle initiiert und sowohl OD (600 nm) als auch Fluoreszenz (505 nm) überwacht eine Funktion der Zeit. Die Helligkeit der Bakterienzellen wurde als Verhältnis zwischen dem Fluoreszenzwert und der OD nach 20-stündigem Wachstum ausgedrückt. Die zytoplasmatischen und periplasmatischen Expressionsniveaus wurden wie zuvor beschrieben durch bakterielle Fraktionierung weiter quantifiziert56. Kurz gesagt, induzierte Bakterienkulturen wurden 10 Minuten lang bei 4 °C mit 3.000 g pelletiert, in 0,5 ml TSE-Puffer (200 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM Saccharose und 1 mM EDTA) resuspendiert und 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. 0,5 ml eiskaltes Wasser wurden hinzugefügt und 30 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert und der Überstand wurde als periplasmatische Fraktion gesammelt. Das Pellet wurde in 5 ml BugBuster-Proteinextraktionsreagenz (Novagen 70921-3) resuspendiert und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur weiter inkubiert. Die Lysate wurden dann 45 Minuten lang bei 4 ° C und 16.000 g zentrifugiert und der Überstand als zytoplasmatische Fraktion gesammelt. Bakterienfraktionen wurden auf SDS-PAGE-12 %-Acrylamidgele geladen und mit Coomassie-Blau sichtbar gemacht. Um gefaltete Proteine in jedem Kompartiment zu quantifizieren, wurden periplasmatische und zytoplasmatische Fraktionen zehnfach in HEPES (pH 7,5) verdünnt und die Fluoreszenzintensitäten aufgezeichnet.

Messungen der Schaltermüdung an lebenden E. coli-Kolonien wurden durch abwechselnde Bestrahlung mit Laserlicht von 405 nm (zum Einschalten der RSFPs) und 488 nm (zum Ausschalten der RSFPs) durchgeführt. Das Licht wurde durch ein 20-fach-Objektiv (NA = 0,4) auf eine Kolonie fokussiert und lieferte Leistungsdichten von ~0,5 kW/cm2 (488 nm) und ~0,1 kW/cm2 (405 nm). Für jedes RSFP wurde die Beleuchtung so kurz wie nötig gehalten, um eine 100 %ige Photoschaltung zu erreichen. Die Fluoreszenz wurde mit einem PMT (Photomultiplier Tube) aufgezeichnet.

Bakterienkulturen wurden in TB-Medium, ergänzt mit 1 % Glycerin, bis zu einer OD von 0,6 gezüchtet und dann über Nacht bei 20 °C mit IPTG induziert. Nach der Induktion wurden die Zellen pelletiert, mit 4 % Paraformaldehyd fixiert (für Weitfeldbildgebung) oder nicht (für RESOLFT-Bildgebung) und dann zweimal mit PBS gewaschen. Ein Tropfen der Zellaufschlämmung wurde auf Glasdeckgläser aufgetragen, die zuvor mit Chitosan (für Weitfeldbildgebung) oder LB-Agar (für RESOLFT-Bildgebung) beschichtet und auf Glasobjektträgern befestigt wurden.

Für Experimente mit Säugetierzellen wurden HeLa-Zellen über Nacht auf Deckobjektträger ausgesät. Die Transfektion wurde mit Turbofect (ThermoFisher Scientific) gemäß dem Handbuch des Herstellers durchgeführt. Nach einem Tag Inkubation wurden die Zellen mit Picodent-Twinsil-Silikon (Picodent, Wipperfürth, Deutschland) auf Objektträger geklebt, um ein Absterben zu verhindern, und anschließend abgebildet.

Weitfeld-Bildgebungsexperimente wurden mit einem IX81 Olympus-Umkehrmikroskop durchgeführt, das mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,49 und einem Anti-Drift-NPS-Objektivrevolver (Olympus) ausgestattet war. Die Proben wurden mit einem zirkular polarisierten 488-nm-Laserstrahl (Spectra-Physics, Santa Clara, USA) mit 300 μW und 23,5 μm FWHM in Gaußform beleuchtet.

Die RESOLFT-Mikroskopie wurde unter Verwendung eines Quad-P-Mikroskops (Abberior Instruments, Göttingen, Deutschland) durchgeführt, das mit einem 100-fachen Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,4 ausgestattet war. RESOLFT-Bilder wurden durch Anwenden der folgenden Beleuchtungssequenz an jeder Scanposition aufgezeichnet: Zuerst wurde rsFolder2 durch Beleuchten mit 405-nm-Licht (30 μs bei 2,2 bis 2,5 μW) in den Ein-Zustand geschaltet. Zweitens wurde ein ringförmiger Strahl aus 488-nm-Licht (640 bis 670 μs bei 14 μW) verwendet, um die Proteine in der Peripherie des Brennflecks in den Aus-Zustand zu schalten. Drittens wurde das Fluoreszenzsignal der restlichen Proteine im eingeschalteten Zustand in der Mitte des Flecks bei 510 nm nach Anregung mit 488-nm-Licht (10 bis 30 μs bei 5 bis 7 μW) aufgezeichnet. Vor und nach dem Ausschalten mit dem Donut-förmigen Strahl wurden kurze Beleuchtungspausen (bis zu 60 μs) in den Schaltablauf eingefügt. Die Scanschrittgröße wurde auf 30 nm eingestellt. Detaillierte Informationen zu den Bildgebungsparametern finden Sie in Tabelle S2.

Transmissionselektronenmikroskopie wurde verwendet, um E. coli BL21 DE3-Zellen sichtbar zu machen, die im Zwischenraum zwischen LB-Agar-Feststoffmedien und einem Elektronenmikroskopiegitter gezüchtet wurden57,58. Kurz gesagt, die Zellen wurden über Nacht bis zu einer optischen Dichte von ~1 bei 600 nm gezüchtet. 20 μl zehnfach verdünnter Zellen wurden auf LB-Agar-Medium aufgetragen, 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, bevor ein Elektronenmikroskopiegitter darüber angebracht wurde. Die Platten wurden weitere 3 Stunden bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden die EM-Gitter vorsichtig entfernt, sechsmal mit einem Tropfen sterilem Wasser gewaschen und dann entweder direkt abgebildet oder nach einer Negativfärbung mit 2 % (Gew./Vol.) Natriumsilikowolframat. Die Bilder wurden unter Niedrigdosisbedingungen mit einem CM12- und Tecnai 12 LaB6-Elektronenmikroskop bei 120 kV und mit nominalen Vergrößerungen von 22.000X und 45.000X unter Verwendung einer Orius TM SC1000 CCD-Kamera von Gatan aufgenommen.

Zitierweise für diesen Artikel: El Khatib, M. et al. Rationales Design ultrastabiler und reversibel photoschaltbarer fluoreszierender Proteine für die hochauflösende Abbildung des bakteriellen Periplasmas. Wissenschaft. Rep. 6, 18459; doi: 10.1038/srep18459 (2016).

Adam V., Berardozzi R., Byrdin M. & Bourgeois D. Phototransformierbare fluoreszierende Proteine: Zukünftige Herausforderungen. Curr Opin Chem Biol 20, 92–102 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fernandez-Suarez M. & Ting AY Fluoreszenzsonden für hochauflösende Bildgebung in lebenden Zellen. Nat Rev Mol Cell Biol 9, 929–943 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Han R., Li Z., Fan Y. & Jiang Y. Jüngste Fortschritte in der hochauflösenden Fluoreszenzbildgebung und ihre Anwendungen in der Biologie. J Genet Genomics 40, 583–595 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hofmann M., Eggeling C., Jakobs S. & Hell SW Durchbrechen der Beugungsbarriere in der Fluoreszenzmikroskopie bei niedrigen Lichtintensitäten durch Verwendung reversibel photoschaltbarer Proteine. Proc Natl Acad Sci USA 102, 17565–17569 (2005).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rego EH et al. Nichtlineare strukturierte Beleuchtungsmikroskopie mit einem photoschaltbaren Protein zeigt Zellstrukturen mit einer Auflösung von 50 nm. Proc Natl Acad Sci USA 109, E135–143 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Dedecker P., Mo GC, Dertinger T. & Zhang J. Weithin zugängliche Methode zur hochauflösenden Fluoreszenzbildgebung lebender Systeme. Proc Natl Acad Sci USA 109, 10909–10914 (2012).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ando R., Mizuno H. & Miyawaki A. Reguliertes schnelles nukleozytoplasmatisches Pendeln, beobachtet durch reversible Proteinhervorhebung. Wissenschaft 306, 1370–1373 (2004).

Artikel CAS ADS PubMed Google Scholar

Andresen M. et al. Photoschaltbare fluoreszierende Proteine ermöglichen monochromatische Multilabel-Bildgebung und zweifarbige Fluoreszenz-Nanoskopie. Nat Biotechnol 26, 1035–1040 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lummer M., Humpert F., Wiedenlubbert M., Sauer M., Schuttpelz M. & Staiger D. Ein neuer Satz reversibel photoschaltbarer fluoreszierender Proteine zur Verwendung in transgenen Pflanzen. Mol Plant 6, 1518–1530 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Stiel AC et al. Erzeugung monomerer, reversibel schaltbarer rot fluoreszierender Proteine für die Fernfeld-Fluoreszenz-Nanoskopie. Biophys J 95, 2989–2997 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Subach FV, Zhang L., Gadella TW, Gurskaya NG, Lukyanov KA & Verkhusha VV Rot fluoreszierendes Protein mit reversibel photoschaltbarer Absorption für photochromen FRET. Chem Biol 17, 745–755 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chang H. et al. Eine einzigartige Serie reversibel schaltbarer fluoreszierender Proteine mit vorteilhaften Eigenschaften für verschiedene Anwendungen. Proc Natl Acad Sci USA 109, 4455–4460 (2012).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adam V. et al. Strukturelle Charakterisierung von IrisFP, einem optischen Highlighter, der mehrere fotoinduzierte Transformationen durchläuft. Proc Natl Acad Sci USA 105, 18343–18348 (2008).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adam V. et al. Rationales Design photokonvertierbarer und biphotochromer fluoreszierender Proteine für fortgeschrittene Mikroskopieanwendungen. Chem Biol 18, 1241–1251 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Grotjohann T. et al. Beugungsunbegrenzte rein optische Bildgebung und Beschriftung mit einem photochromen GFP. Natur 478, 204–208 (2011).

Artikel CAS ADS PubMed Google Scholar

Grotjohann T. et al. rsEGFP2 ermöglicht die schnelle RESOLFT-Nanoskopie lebender Zellen. Elife 1, e00248 (2012).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duwe S. et al. Expressionsverstärkte fluoreszierende Proteine basierend auf verstärktem grün fluoreszierenden Protein für hochauflösende Mikroskopie. ACS Nano, (2015).

Tiwari DK et al. Ein schnell und positiv photoschaltbares fluoreszierendes Protein für die RESOLFT-Nanoskopie mit extrem geringer Laserleistung. Nat Methods 12, 515–518 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang X. et al. Entwicklung eines reversibel schaltbaren Fluoreszenzproteins für die hochauflösende optische Fluktuationsbildgebung (SOFI). ACS Nano 9, 2659–2667 (2015).

Artikel CAS ADS PubMed Google Scholar

Aronson DE, Costantini LM, Snapp EL und Superfolder GFP fluoreszieren in oxidierenden Umgebungen, wenn es über das Sec-Translokon angegriffen wird. Verkehr 12, 543–548 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stock JB, Rauch B. & Roseman S. Periplasmatischer Raum in Salmonella typhimurium und Escherichia coli. J Biol Chem 252, 7850–7861 (1977).

CAS PubMed Google Scholar

Dammeyer T. & Tinnefeld P. Konstruierte fluoreszierende Proteine beleuchten das bakterielle Periplasma. Comput Struct Biotechnol J 3, e201210013 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Alekshun MN & Levy SB Molekulare Mechanismen antibakterieller Multiresistenz. Zelle 128, 1037–1050 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Seiten JM, James CE & Winterhalter M. Das Porin und das durchdringende Antibiotikum: eine selektive Diffusionsbarriere in gramnegativen Bakterien. Nat Rev Microbiol 6, 893–903 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Desvaux M., Hebraud M., Talon R. & Henderson IR Sekretion und subzelluläre Lokalisierung bakterieller Proteine: ein Problem des semantischen Bewusstseins. Trends Microbiol 17, 139–145 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Economou A. Bakterielles Sekretom: das Montagehandbuch und die Bedienungsanleitung (Rezension). Mol Membr Biol 19, 159–169 (2002).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Luirink J. & Sinning I. SRP-vermitteltes Protein-Targeting: Struktur und Funktion überarbeitet. Biochim Biophys Acta 1694, 17–35 (2004).

CAS PubMed Google Scholar

Neumann-Haefelin C., Schafer U., Muller M. & Koch HG SRP-abhängiges co-translationales Targeting und SecA-abhängige Translokation als einzelne Schritte beim Export eines bakteriellen Proteins analysiert. EMBO J 19, 6419–6426 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Feilmeier BJ, Iseminger G., Schroeder D., Webber H. & Phillips GJ Grün fluoreszierendes Protein fungiert als Reporter für die Proteinlokalisierung in Escherichia coli. J Bacteriol 182, 4068–4076 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dinh T. & Bernhardt TG Verwendung von grün fluoreszierendem Superfolder-Protein für periplasmatische Proteinlokalisierungsstudien. J Bacteriol 193, 4984–4987 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pedelacq JD, Cabantous S., Tran T., Terwilliger TC und Waldo GS Engineering und Charakterisierung eines grün fluoreszierenden Superfalterproteins. Nat Biotechnol 24, 79–88 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zacharias DA, Violin JD, Newton AC & Tsien RY Partitionierung von Lipid-modifizierten Monomer-GFPs in Membranmikrodomänen lebender Zellen. Wissenschaft 296, 913–916 (2002).

Artikel CAS ADS PubMed Google Scholar

Brakemann T. et al. Ein reversibel photoschaltbares GFP-ähnliches Protein mit vom Schalten entkoppelter Fluoreszenzanregung. Nat Biotechnol 29, 942–947 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bourgeois D. & Adam V. Reversibles Photoschalten in fluoreszierenden Proteinen: eine mechanistische Sicht. IUBMB Life 64, 482–491 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wilmann PG et al. Die 1,7 A-Kristallstruktur von Dronpa: einem photoschaltbaren grün fluoreszierenden Protein. J Mol Biol 364, 213–224 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Henderson JN, Ai HW, Campbell RE und Remington SJ Strukturelle Grundlage für die reversible Photobleichung eines grün fluoreszierenden Proteinhomologen. Proc Natl Acad Sci USA 104, 6672–6677 (2007).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stiel AC et al. 1.8 Eine Bright-State-Struktur des reversibel schaltbaren Fluoreszenzproteins Dronpa leitet die Erzeugung schnell schaltender Varianten. Biochem J 402, 35–42 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Beveridge TJ Strukturen gramnegativer Zellwände und der daraus abgeleiteten Membranvesikel. J Bacteriol 181, 4725–4733 (1999).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kojer K. & Riemer J. Ausgleich der oxidativen Proteinfaltung: die Einflüsse reduzierender Wege auf die Bildung von Disulfidbindungen. Biochim Biophys Acta 1844, 1383–1390 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li D. et al. Strukturierte Beleuchtungsbildgebung mit erweiterter Auflösung der endozytischen und zytoskelettalen Dynamik. Wissenschaft 349, aab3500 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gibson DG, Young L., Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, 3rd & Smith HO Enzymatische Anordnung von DNA-Molekülen mit bis zu mehreren hundert Kilobasen. Nat Methods 6, 343–345 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Flot D. et al. Die Strukturbiologie-Mikrofokus-Strahllinie ID23-2 am ESRF. J Synchrotron Radiat 17, 107–118 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

de Sanctis D. et al. ID29: eine hochintensive, hochautomatisierte ESRF-Strahllinie für makromolekulare Kristallographieexperimente unter Ausnutzung anomaler Streuung. J Synchrotron Radiat 19, 455–461 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kabsch W. Automatische Verarbeitung von Rotationsbeugungsdaten von Kristallen zunächst unbekannter Symmetrie und Zellkonstanten. J Appl Crystallogr 26, 795–800 (1993).

Artikel CAS Google Scholar

McCoy AJ, Grosse-Kunstleve RW, Adams PD, Winn MD, Storoni LC & Read RJ Phaser Kristallographiesoftware. J Appl Crystallogr 40, 658–674 (2007).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Emsley P., Lohkamp B., Scott WG & Cowtan K. Merkmale und Entwicklung von Blässhuhn. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 486–501 (2010).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murshudov GN et al. REFMAC5 zur Verfeinerung makromolekularer Kristallstrukturen. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 67, 355–367 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adams PD et al. PHENIX: ein umfassendes Python-basiertes System zur Lösung makromolekularer Strukturen. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 213–221 (2010).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DeLano W. Das PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.5.0.4 Schrödinger, LLC., (2002).

Schuck P. Größenverteilungsanalyse von Makromolekülen durch Sedimentationsgeschwindigkeits-Ultrazentrifugation und Lamm-Gleichungsmodellierung. Biophys J 78, 1606–1619 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ward WW Eigenschaften der coelenteraten grün fluoreszierenden Proteine. In: Biolumineszenz und Chemilumineszenz: grundlegende Chemie und analytische Anwendungen (Hrsg. DeLuca MA, McElroy WD). Academic Press (1981).

Williams ATR, Winfield SA & Miller JN Relative Fluoreszenzquantenausbeuten unter Verwendung eines computergesteuerten Lumineszenzspektrometers. The Analyst 108, 1067 (1983).

Artikel CAS ADS Google Scholar

Duan C., Byrdin M., El Khatib M., Adam V. & Bourgeois D. Rationales Design einer erhöhten Photoresistenz in einem photoschaltbaren fluoreszierenden Protein. Methoden Appl Fluoresc 3, (2015).

Moore MM, Oteng-Pabi SK, Pandelieva AT, Mayo SL und Chica RA Wiederherstellung des Reifungsmangels des rot fluoreszierenden Proteinchromophors durch rationales Design. PLoS One 7, e52463 (2012).

Artikel CAS ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Studier FW Proteinproduktion durch Autoinduktion in Schüttelkulturen hoher Dichte. Protein Expr Purif 41, 207–234 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Quan S., Hiniker A., Collet JF & Bardwell JC Isolierung von Bakterienhüllenproteinen. Methoden Mol Biol 966, 359–366 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

de Jong IG, Beilharz K., Kuipers OP & Veening JW Live Cell Imaging von Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae mittels automatisierter Zeitraffermikroskopie. J Vis Exp, (2011).

Dubey GP & Ben-Yehuda S. Interzelluläre Nanoröhren vermitteln die bakterielle Kommunikation. Zelle 144, 590–600 (2011).

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Diese Arbeit nutzte die Plattformen des Grenoble Instruct Center (ISBG: UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL) mit Unterstützung von FRISBI (ANR-10-INSB-05-02) und GRAL (ANR-10-LABX-49-01). ) im Rahmen der Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB). Unterstützung für diese Arbeit kommt von der Agence Nationale de la Recherche (ANR-2011-BSV5-012-01 NOBLEACH an DB und ANR-12-BS07-0008-03 Multiclick an JPC) und von der Université Grenoble Alpes (AGIR NanOxyd an VA ). Tim Grotjohann und Stefan Jakobs vom Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie, Göttingen, danken wir herzlich für die Aufnahme und Datenverarbeitung der RESOLFT-Bilder sowie für aufschlussreiche Diskussionen. Wir danken Aline Le Roy und Christine Ebel von der ISBG PAOL-Plattform für die Durchführung analytischer Ultrazentrifugationsexperimente bzw. die Verarbeitung der Daten und Daphna Fenel für die Sammlung elektronenmikroskopischer Aufnahmen. Die Elektronenmikroskopie-Einrichtung wird von der Region Rhône-Alpes, der Fondation Recherche Medicale (FRM), dem Fonds Européen de Développement Régional (FEDER), dem CNRS, dem CEA, der Universität Grenoble, dem EMBL und den GIS-Infrastrutures en Biologie unterstützt , Santé et Agronomie (IBISA). Wir danken Martin Byrdin und Duan Chenxi herzlich für ihre Hilfe bei der Messung von Photoschaltzyklen in Lösung für die in dieser Arbeit untersuchten Proteine. Wir danken Martin Weik für das Korrekturlesen des Manuskripts und die kontinuierliche Unterstützung. Wir danken der ESRF für die Strahlzeit im Rahmen der Langzeitprojekte MX1464, MX1583 und MX1676 (IBS BAG). Finanzielle Unterstützung durch CEA, CNRS und Univ. Grenoble-Alpen. MEK wird von einem Ph.D. unterstützt. Stipendium der Grenoble Alliance for Integrated Structural Cell Biology (GRAL) und der französischen Atomenergiekommission (CEA).

Univ. Grenoble Alpes, IBS, F-38044, Grenoble, Frankreich

Mariam El Khatib, Alexandre Martins, Dominique Bourgeois, Jacques-Philippe Colletier und Virgile Adam

CNRS, IBS, F-38044, Grenoble, Frankreich

Mariam El Khatib, Alexandre Martins, Dominique Bourgeois, Jacques-Philippe Colletier und Virgile Adam

CEA, IBS, F-38044, Grenoble, Frankreich

Mariam El Khatib, Alexandre Martins, Dominique Bourgeois, Jacques-Philippe Colletier und Virgile Adam

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MEK, JPC und VA konzipierten Forschung. MEK-, ADM- und VA-vorbereitete Proben; MEK und VA führten biochemische und photophysikalische Experimente durch und verarbeiteten die Daten; MEK und VA führten Bildgebungsexperimente durch; MEK, JPC und VA verarbeiteten kristallographische Daten; MEK und VA verfeinerten die Strukturen; MEK, DB, JPC und VA analysierten die Daten; DB und JPC haben das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren verfasst.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

El Khatib, M., Martins, A., Bourgeois, D. et al. Rationales Design ultrastabiler und reversibel photoschaltbarer fluoreszierender Proteine für die hochauflösende Abbildung des bakteriellen Periplasmas. Sci Rep 6, 18459 (2016). https://doi.org/10.1038/srep18459

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Eingegangen: 28. Oktober 2015

Angenommen: 11. November 2015

Veröffentlicht: 06. Januar 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep18459

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Rationales Design ultrastabiler und reversibel photoschaltbarer fluoreszierender Proteine ​​für Super

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