Identifizierung kleiner Moleküle, die die virale Membranfusion verbessern können

Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 99 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Zur Analyse des Eindringens hochpathogener Viren wurden mehrere Ansätze entwickelt. In dieser Studie berichten wir über die Implementierung eines BiMuC-Assays (Bimolecular Multizelluläre Komplementation) zur sicheren und effizienten Überwachung der SARS-CoV-2 S-vermittelten Membranfusion, ohne dass mikroskopische Geräte erforderlich sind. Mithilfe von BiMuC haben wir eine Bibliothek zugelassener Medikamente gescreent und Verbindungen identifiziert, die die S-Protein-vermittelte Zell-Zellmembran-Fusion verbessern. Unter anderem fördert Ethinylestradiol in vitro das Wachstum des SARS-CoV-2- und des Influenza-A-Virus. Unsere Ergebnisse zeigen das Potenzial von BiMuC zur Identifizierung kleiner Moleküle, die den Lebenszyklus umhüllter Viren, einschließlich SARS-CoV-2, modulieren.

Das neuartige schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) [1, 2] hat die als Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) bekannte pandemische Erkrankung verursacht. Diese Krankheit hatte und hat weiterhin enorme Auswirkungen auf unsere Gesundheitssysteme und die Weltwirtschaft. Dementsprechend wurden außerordentliche Anstrengungen unternommen, um prophylaktische und therapeutische Maßnahmen zu entwickeln, um die mit der COVID-19-Erkrankung verbundene Morbidität und Mortalität zu reduzieren.

Die Zellmembran ist die erste Barriere, auf die das Virus trifft, wenn es eine neue Zelle infiziert. Irgendwann beim Eindringen müssen umhüllte Viren die Zell- und Virusmembranen verschmelzen lassen. Im Fall von SARS-CoV-2 ist das hochglykosylierte Spike (S)-Protein dafür verantwortlich, in die Wirtszellen einzudringen [3]. Das S-Protein, ein trimeres Fusionsprotein der Klasse I [4], wird in eine nichtaktive Form (S0) translatiert. Die proteolytische Aktivierung von S0 durch Wirtsproteasen (z. B. TMPRSS2) erzeugt das reife Präfusions-S-Protein, das in die Virionen eingebaut wird [5]. Der Infektionsprozess beginnt mit der Bindung des S-Proteins an das Angiotensin-Converting-Enzym 2 (ACE2) an der Zelloberfläche [2, 6]. Die Bindung an ACE2 löst eine Konformationsänderung aus, die zur Freilegung des S-Protein-Fusionspeptids führt, das mit der Wirtsmembran interagiert und die Fusion der viralen und zellulären Membranen initiiert. Die Erleichterung eines der zahlreichen Schritte in diesem komplexen Prozess würde die Virusproduktion beschleunigen und steigern, die Entwicklung traditioneller Impfstoffe beschleunigen, die Produktionskosten senken und die Produktionsausbeute steigern [7].

Zur sicheren Analyse des Viruseintritts wurden mehrere Ansätze entwickelt, darunter Tests auf der Basis pseudotypisierter Viren, Tests auf der Basis viraler Partikel, biochemische Tests oder Zell-Zell-Fusionstests. Die Identifizierung von Synzyten erfolgt aufgrund der Expression der viralen Fusionsmaschinerie und des entsprechenden Wirtsrezeptors auf der Zelloberfläche traditionell durch Mikroskopie. Mikroskopbasierte Methoden behindern jedoch die Quantifizierung des Fusionsprozesses und die Implementierung von Hochdurchsatzmethoden zur Identifizierung kleiner Moleküle.

Um den SARS-CoV-2 S-vermittelten Membranfusionsprozess zu untersuchen, haben wir beschlossen, den kürzlich entwickelten BiMuC-Assay (Bimolecular Multizelluläre Komplementation) anzupassen [8]. Basierend auf den bimolekularen Komplementationseigenschaften eines fluoreszierenden Reporterproteins erleichtert dieser Assay die Identifizierung und Quantifizierung viral induzierter Zell-Zell-Fusionsereignisse ohne die Unterstützung mikroskopbasierter Geräte. Nachdem wir BiMuC für die Untersuchung von SARS-CoV-2 eingesetzt hatten, richteten wir ein Screening für kleine Moleküle ein, die in der Lage sind, den S-Protein-vermittelten Membranfusionsprozess zu modulieren. Wir haben mit diesem Assay 1280 kleine Moleküle gescreent und festgestellt, dass Ethinylestradiol die S-Protein-vermittelte Zell-Zellmembran-Fusion verstärkt. Dadurch steigert Ethinylestradiol das Wachstum von SARS-CoV-2 in vitro. Darüber hinaus ist die Wirkung auf die viral vermittelte Membranfusion nicht auf SARS-CoV-2 beschränkt. Wir haben gezeigt, dass Ethinylestradiol das Wachstum des Influenza-A-Virus und die Membranfusion des Nipah-Virus steigern kann. Unsere Ergebnisse zeigen, dass BiMuC eingesetzt werden könnte, um den SARS-CoV-2-Membranfusionsprozess zu überwachen und kleine Moleküle zu identifizieren, die diesen Prozess stören.

Hek 293T-, Vero E6- und Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) wurden von ATCC (http://www.atcc.org) erhalten und in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, http://www .lifetechnologies.com), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Gibco). Das SARS-CoV-2 S-Plasmid war ein Geschenk von Dr. F. Krammer (Ichan School of Medicine am Berg Sinai). Das Jun-Nt-VFP (Jun) und das Fos-Ct-VFP (Fos) sowie die humanen ACE2- und TMPRSS2-exprimierenden Plasmide wurden von Addgene erhalten (Nr. 22.012, Nr. 22.013, Nr. 1786 bzw. Nr. 53.887).

Um die Membranfusionseigenschaften von SARS-CoV-2 zu untersuchen, wurden Hek 293T-Zellen (DMEM, ergänzt mit 10 % FBS) mit Polyethylenimin (PEI) [9] transfiziert, entweder mit SARS-CoV-2 S und Jun oder mit ACE2 und Fos plus pRL Renilla Luciferase (Promega) zur Normalisierung des Signals. Zusätzlich haben wir die Kombinationen SARS-CoV-2 S-Fos und ACE2-Jun erneut mit der pRL Renilla Luciferase getestet. Am nächsten Tag wurden die Zellen gezählt, gemischt und in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät (1 × 105 Zellen/Vertiefung in 100 µL Medium). Nach 48 Stunden wurde die Fluoreszenz auf 96-Well-Platten gemessen (λexc = 485 nm, λem = 535 nm), wie zuvor beschrieben [10].

Zur Identifizierung kleiner Moleküle mit der Fähigkeit, die Membranfusion zu modulieren, wurde das Protokoll angepasst, um den erforderlichen Screening-Standards zu entsprechen. Um die Robustheit unseres Assays zu bewerten, haben wir den Z′-Faktor und das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) berechnet. Z′-Faktor = 1 − ((3δpos + 3δneg)/(µpos − µneg)), wobei µpos das mittlere Signal für die Positivkontrolle ist, µneg das mittlere Signal für die negative Kontrolle ist, δpos die Standardabweichung der positiven Kontrolle ist Kontrolle und δneg ist die Standardabweichung für die Negativkontrolle. Kurz gesagt, Hek 293T-Zellen wurden in 15-cm-Schalen (5 × 106 Zellen/Schale) unter Verwendung von DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, ausgesät. Nach 24-stündiger Inkubation (37 °C, 5 % CO2) wurden die Zellen unter Verwendung von PEI mit den oben genannten Plasmidkombinationen transfiziert oder scheintransfiziert. Am nächsten Tag wurden die Zellen gezählt, gemischt und manuell in feste schwarze 96-Well-Platten ausgesät (1 × 105 Zellen/Well in 100 µL Medium). Die Zellen wurden in zwei Pools gemischt, wobei Pool A Zellen enthielt, die Jun und SARS-CoV-2 S oder Fos und ACE2 exprimierten, und Pool B Zellen enthielt, die Jun oder Fos exprimierten. Die Vertiefungen in den Spalten 1–11 wurden mit 50 µL Zellen aus Pool A besät, während Spalte 12 50 µL Zellen aus Pool B erhielt. Als nächstes wurden 50 µL der kleinen Verbindungen mit 50 µM manuell zu den Zellen gegeben (Endkonzentration 25 µM). , 0,25 % DMSO). Wir verwendeten eine Prestwick Chemical-Bibliothek (Sigma, St. Louis, MO, USA), die 1280 Verbindungen in 96-Well-Platten enthielt. Die Spalten 1 und 12 (Positiv- bzw. Negativkontrollen) wurden in jeder Platte mit DMSO behandelt. Nach 48-stündiger Inkubation wurden die Medien durch 100 µl PBS ersetzt und die Fluoreszenz in einem VictorX-Mehrplattenlesegerät (Perking Elmer, Waltham, MA, USA) gemessen. Die auf dem Bildschirm erhaltenen Ergebnisse wurden mithilfe des Z-Scores standardisiert, der wie folgt berechnet wurde: Z-Score = (x − µ)/δ, wobei x das Rohsignal, µ das mittlere Signal und δ die Standardabweichung aller ist die verbindungshaltigen Vertiefungen einer Platte. Der Z-Score gibt an, um wie viele Standardabweichungen eine bestimmte Verbindung über oder unter dem Mittelwert der Platte liegt. Primäre Treffer wurden durch die Berechnung eines Z-Scores für jede Verbindung und die Anwendung von Trefferauswahlkriterien identifiziert; Z-Score > 1,5. Treffer wurden im Sekundärscreening bestätigt. Diesmal enthielten die Zellen pRL-Renilla. Die Lumineszenz wurde mit dem Renilla Luciferase Assay Kit von Sigma gemäß dem Herstellerprotokoll auf weißen Zellkulturplatten mit 96 Vertiefungen gemessen. Diese Maßnahme erleichtert die Eliminierung derjenigen Verbindungen, die die Zellteilung oder das Überleben fördern, wodurch das Fluoreszenzsignal erhöht wird, ohne dass die Zell-Zell-Fusion wirksam gesteigert wird. Um die Treffer zu verwerfen, die VFP-ähnliche Fluoreszenzeigenschaften aufwiesen, wurden Zellen in schwarze 96-Well-Platten ausgesät und mit den Verbindungen unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben behandelt. In diesem Fall wurde die Fluoreszenz wie zuvor gemessen (λexc = 485 nm, λem = 535 nm). In allen Tests wurde [DMSO] bei ≤ 1 % gehalten. Die statistische Analyse wurde mit Libre Office Calc durchgeführt.

Um die Wirkung auf die durch das Nipah-Virus induzierte Membranfusion zu untersuchen, führten wir den ursprünglichen BiMuC-Assay durch, der in [8] beschrieben ist. In diesem Fall wurden Hek 293T-Zellen mit Jun-Nt, NiV F und G oder mit Fos-Ct und einem für Renilla-Luciferase kodierenden Plasmid (pRL, Promega) transfiziert. Als nächstes wurden die Zellpools gemischt und mit der angegebenen Verbindung behandelt (DMSO-Konzentration wurde bei 1 % gehalten). Nach 48 Stunden wurde die Fluoreszenz gemessen. Es wurden mindestens drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Die Toxizität der Verbindungen wurde mit Cell-Titer Glo (Promega) gemäß den Angaben des Herstellers bewertet. Kurz gesagt, die Zellen wurden in einer undurchsichtigen weißen 96-Well-Platte ausgesät (~ 1 × 104 Zellen/Platte) und 48 Stunden lang mit der entsprechenden Verbindung in der angegebenen Konzentration behandelt. Als nächstes wurden 100 µl CellTiter-Glo®-Reagenz hinzugefügt und das Lumineszenzsignal 10 Minuten lang stabilisieren lassen. Die Lumineszenz wurde auf einem VictorX-Mehrplattenlesegerät (Perking Elmer, Waltham, MA, USA) aufgezeichnet.

Vero E6-Zellen wurden mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,01 mit SARS-CoV-2 infiziert. Als nächstes wurden Ethaverin, Rabeprazol oder Ethinylestradiol in der entsprechenden Konzentration hinzugefügt. Zusätzlich wurden die Zellen mit DMSO behandelt. Nach 48 Stunden wurden die Überstände gesammelt und mittels Standard-Plaque-Assay in VeroE6-Zellen titriert. Alternativ wurden MDCKs-Zellen mit IAV/WSN/33 bei einer MOI von 0,001 infiziert. Die Proben wurden in Abwesenheit oder Gegenwart von Ethaverin, Rabeprazol oder Ethinylestradiol bei den angegebenen Konzentrationen 48 Stunden lang inkubiert. Als nächstes wurden die Überstände gesammelt und mit der 50 % Tissue Culture Infective Dose (TCID50)-Methode in MDCK-Zellen titriert. In allen Tests wurde [DMSO] bei ≤ 1 % gehalten.

Analyse der SARS-CoV-2-Membranfusion durch BiMuC. Eine schematische Darstellung des BiMuC-Assays. Die Jun- und Fos-Proteine wurden an die Nt- bzw. Ct-Enden des VFP fusioniert, um die VN-Jun- und VC-Fos-Chimären zu erzeugen, die von nun an einfach als Jun und Fos dargestellt werden. Die Wiederherstellung der Struktur des VFP (grün dargestellt) und damit seiner Fluoreszenzeigenschaften erfolgt ausschließlich nach der Jun- und Fos-Wechselwirkung. Wenn die VN-Jun- und VC-Fos-Chimären in getrennten Zellpools exprimiert werden, ist keine Rekonstitution möglich (links). Die SARS-CoV-2-Membranfusion beruht auf der erfolgreichen Interaktion zwischen SARS-CoV-2 S und menschlichem ACE2. Die Expression dieser beiden Proteine auf der Oberfläche zweier benachbarter Zellen führt zur Verschmelzung der Zellmembranen und zur Bildung eines Synzytiums (Mitte). Wenn die fusionierten Zellen die VN-Jun- und VC-Fos-Chimären tragen, können sie die native VFP-Struktur wiederherstellen (grün dargestellt, links). Im Gegenteil führt die Hemmung eines der zellulären oder viralen Prozesse, die zur Membranfusion führen, von der Synthese und Reifung des S-Proteins bis zu seiner Interaktion mit ACE2, zum Fehlen eines Fluoreszenzsignals. B Für den Zell-Zell-Fusionstest wurden Hek 293T-Zellen mit den angegebenen Plasmidkombinationen transfiziert. Das heißt: Jun + SARS-CoV-2 S, Fos + hACE2, Jun + hACE2, Fos + SARS-CoV-2 S, Jun + Fos, Jun, Fos, SARS-CoV-2 S, hACE2, Fos + hACE2 + TMPRSS2. Am nächsten Tag wurden die Zellen in jedem Zellpool gezählt und wie angegeben gemischt. Nach 48 Stunden wurde die Fluoreszenz gemessen. Dargestellt sind der Mittelwert und die Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten (n-Werte 7, 6, 6, 6, 3, 3). Ein ausgefüllter Punkt repräsentiert den individuellen Wert jedes Experiments. Grüne Balken kennzeichnen Proben mit Fluoreszenzniveaus, die mit denen der Positivkontrolle (Jun-Fos) vergleichbar sind. Statistische Unterschiede basieren auf einem zweiseitigen homoskedastischen t-Test (p-Werte werden über dem entsprechenden Balken angezeigt, ns nicht signifikant)

Das neuartige SARS-CoV-2 ist ein hochansteckender Erreger. Dementsprechend erfordert seine Handhabung erhebliche Sicherheitsmaßnahmen, die Forschungsprotokolle erschweren können. Um die Untersuchung des SARS-CoV-2 S-vermittelten Membranfusionsprozesses zu erleichtern, haben wir uns für die Implementierung eines fluoreszenzbasierten Komplementationsassays entschieden [8]. Der BiMuC-Ansatz ist ein sicherer, virusfreier Ansatz, der auf den strukturellen Eigenschaften einiger fluoreszierender Proteine wie dem Venus Fluorescent Protein (VFP) basiert [10,11,12,13]. Kurz gesagt, das VFP kann in zwei Fragmente (VN bzw. VC) gespalten werden, von denen keines für sich allein fluoreszierend ist. Wenn diese beiden Fragmente jedoch mit einem Paar interagierender Proteine fusioniert werden, die sie zusammenbringen, wird die native Struktur des VFP wiederhergestellt und seine Fluoreszenzeigenschaften werden wiederhergestellt. Die Chimären werden in getrennten Zellpools zusammen mit der für die Membranfusion erforderlichen Virusmaschinerie exprimiert. Wenn die Membranfusion die fluoreszierenden Chimären in die Nähe bringt, würde die Fluoreszenz wiederhergestellt. Im Gegenteil würde kein Signal abgerufen werden, wenn die Bedingungen für die Bildung eines Synzytiums nicht erfüllt wären (Abb. 1A).

Identifizierung kleiner Moleküle. Eine schematische Darstellung des BiMuC-Assays zur Identifizierung kleiner Moleküle mit membranfusionsfördernden Eigenschaften. B Workflow-Darstellung des Screenings kleiner Moleküle und Validierung der resultierenden Treffer

Um zu testen, ob wir diese Methodik auf die Untersuchung der SARS-CoV-2-induzierten Membranfusion anwenden können, wurden die interagierenden Partner c-Jun und c-Fos [14] mit den VN- und VC-Fragmenten des VFP verknüpft, wodurch c erzeugt wurde -Jun/VN- und c-Fos/VC-Chimären, von nun an einfach als Jun und Fos dargestellt. Diese Chimären wurden in zwei unabhängigen Zellpools mit SARS-CoV-2 S (Jun-S) bzw. ACE2 (Fos-ACE2) exprimiert. Darüber hinaus haben wir mit Jun und Fos zusammen transfizierte Zellen (Jun-Fos), Jun, Fos, S, ACE2 oder ein leeres Plasmid (Empty) in den Test einbezogen. Nach der Transfektion wurden die Zellpools wie angegeben kombiniert und weitere 48 Stunden lang inkubiert (Abb. 1B). Die Proben, die mit Jun-S und Fos-ACE2 transfizierte Zellen enthielten, zeigten ein deutlich stärkeres Fluoreszenzsignal als diejenigen, die Pools von Zellen kombinierten, die Jun und Fos oder S und ACE2 exprimierten (Negativkontrollen), was darauf hindeutet, dass eine erfolgreiche Fusion der Zellmembranen durch das ausgelöst wurde Die virale Maschinerie brachte die beiden Chimären zusammen und erleichterte die Wiederherstellung des Fluoreszenzsignals (Abb. 1B). Beachten Sie, dass wir auch die Kombinationen Jun-ACE2 und Fos-S getestet haben. Unsere Daten legen nahe, dass die BiMuC-Methodik zur sicheren Untersuchung der SARS-CoV-2-vermittelten Membranfusion eingesetzt werden könnte. Bilder von SARS-CoV-2 S-induzierten Synzytien finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

Die Identifizierung kleiner Moleküle, die den viralen Lebenszyklus beeinflussen, erfordert häufig skalierbare und robuste Protokolle für das Hochdurchsatz-Screening (HTS). Auch bei hochpathogenen Viren wie SARS-CoV-2 sollen diese Verfahren sicher sein. Um zu zeigen, dass der SARS-CoV-2-BiMuC-Assay unter Hochdurchsatzbedingungen eingesetzt werden kann, haben wir einen Assay zur Identifizierung kleiner Moleküle entwickelt, die den SARS-CoV-2 S-vermittelten Membranfusionsprozess beeinflussen. Unser besonderes Interesse galt kleinen Molekülen, die den Viruseintritt verstärken könnten. Trotz der Einführung neuer Impfstoffplattformen ist die Impfstoffproduktion häufig auf die Produktion großer Virusmengen angewiesen. Dementsprechend wurden verschiedene Strategien umgesetzt, um die Virusproduktion zu steigern, von der Zellselektion bis zur Optimierung von Replikationsverfahren [15,16,17]. Ein Molekül, das die Virus-Membran-Fusion erleichtern kann, würde theoretisch das Viruswachstum steigern und könnte zur Erleichterung der herkömmlichen Impfstoffproduktion verwendet werden [7].

Unser Assay basiert auf Hek 293T-Zellen, die geringe Mengen an ACE2 und TMPRSS2 exprimieren [18, 19]. Während ACE2 in trans ergänzt wurde, haben wir TMPRSS2 absichtlich nicht in unseren Test einbezogen, um einen suboptimalen Fusionszustand zu erreichen, der die Identifizierung kleiner Moleküle erleichtert, die die Synzytienbildung fördern. Eine Beschleunigung oder Steigerung der Virusproduktion würde die Impfstoffentwicklung beschleunigen, die Produktionskosten senken und die Produktionsausbeute erhöhen [20]. Um zu bestätigen, dass unser Assay einen Anstieg der Virusfusion identifizieren kann, haben wir TMPRSS2 in den Transfektionsmix mit ACE2 (Fos-ACE2-TMPRSS2) aufgenommen. Wie erwartet erhöhte die Zugabe dieser Serinprotease das beobachtete Fluoreszenzsignal (Abb. 1B). Diese Ergebnisse bestätigen, dass unser Aufbau Verbindungen identifizieren konnte, die die Fusion von Virus-Zellmembranen verbessern.

Als nächstes passten wir unsere Methodik für die HTS kleiner Moleküle an und überprüften ihre Eignung anhand des Z′-Faktors (0,63 oder 0,62 für die Jun-S + Fos-ACE2- bzw. Jun-ACE2 + Fos-S-Kombinationen) [21]. Kurz gesagt, Hek 293T-Zellen wurden mit Jun-S oder Fos-ACE2 plus einem Plasmid, das die Renilla-Luciferase unter einem konstitutiven Promotor kodiert, transfiziert. Nach der Transfektion wurden die Zellpools wie oben beschrieben gemischt, auf 96-Well-Platten ausgesät und mit dem entsprechenden kleinen Molekül behandelt. Jede Platte enthielt eine Spalte mit mit DMSO behandelten Vertiefungen. Darüber hinaus enthielten die Platten 8 Vertiefungen als Negativkontrolle, die mit Jun oder Fos transfizierte und mit DMSO behandelte Zellen enthielten (beide Zellpools wurden wie zuvor kombiniert). Nach der Behandlung wurden die Zellen 48 Stunden lang inkubiert, gefolgt von einer Fluoreszenzmessung und einer Trefferselektion (Abb. 2A).

Analyse von Trefferverbindungen. A–F Ausgewählte Verbindungen wurden zurückgekauft und ihre Fähigkeit, die Synzytienbildung zu steigern, wurde mit dem BiMuC-Assay getestet. Kurz gesagt, Hek293T-Zellen wurden mit Jun plus SARS-CoV 2 S-Proteinen und unabhängig davon mit Fos und menschlichem ACE2 transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Proben kombiniert und mit der entsprechenden Verbindung in der angegebenen Konzentration behandelt oder 48 Stunden lang einer Scheinbehandlung unterzogen. Als nächstes wurde die Fluoreszenz berechnet, die den Prozentsatz der Fusion angibt. Dargestellt sind die Fluoreszenzprozentsätze der mit Schein (DMSO) behandelten Proben. Dargestellt sind der Durchschnitt und die Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Punkte stellen einzelne Experimente dar. Basierend auf einem einseitigen homoskedastischen T-Test wurden statistische Unterschiede zwischen zusammengesetzten und scheinbehandelten Proben berechnet. Der p-Wert wird angezeigt, wenn signifikante Unterschiede festgestellt werden

Eine Bibliothek bestehend aus 1280 chemisch unterschiedlichen kleinen Molekülen (Prestwick Chemical, GreenPharma) wurde gescreent und die Ergebnisse wurden durch den Z-Score standardisiert; 76 Primärtreffer wurden basierend auf einem Z-Score > 1,5 ausgewählt (Tabelle S1). Die Treffer wurden unter Verwendung derselben Versuchsbedingungen und Auswahlkriterien erneut getestet. Es wurden nur die Verbindungen berücksichtigt, die in beiden Runden die Virusfusion verstärken konnten (Abb. 2B). Darüber hinaus haben wir die Lumineszenz der Renilla-Luciferase gemessen und diejenigen Verbindungen eliminiert, die die Zellteilung oder das Überleben fördern, wodurch das Fluoreszenzsignal erhöht wurde, ohne die Zell-Zell-Fusion effektiv zu steigern. Wir haben auch die Fluoreszenzeigenschaften der verbleibenden Treffer getestet und diejenigen Verbindungen verworfen, die nahe 530 nm emittieren (Abb. 2B).

Insgesamt wurden 6 Verbindungen ausgewählt; Diese wurden von einem anderen Anbieter zurückgekauft und in mehreren Konzentrationen erneut getestet, um ihre Fähigkeit zu bestätigen, die virale Membranfusion in Hek 293T zu verbessern. Die Verbindungen wurden 48 oder 72 Stunden lang inkubiert (Abb. 3 und 4). Wir beobachteten einen leichten Anstieg der viral induzierten Membranfusion, wenn die Verbindungen 48 Stunden lang inkubiert wurden; Latanoprost, Simvastatin und Ethinylestradiol waren die stärkeren Induktoren. Allerdings verstärken die meisten Verbindungen (außer Diperodon) nach 72-stündiger Inkubation das Fluoreszenzsignal. Bei einer 48-stündigen Inkubation der Verbindungen wurde eine begrenzte Dosisreaktion beobachtet. Allerdings wurde 72 Stunden nach der Behandlung eine stärkere Dosisabhängigkeit beobachtet.

Analyse der Trefferverbindungen nach 72-stündiger Inkubation. A–F Die Fähigkeit der ausgewählten Verbindungen, die Synzytienbildung zu steigern, wurde mit dem BiMuC-Assay in Hek293T-Zellen getestet. Kurz gesagt, Hek293T-Zellen wurden mit Jun plus SARS-CoV 2 S-Proteinen und unabhängig davon mit Fos und menschlichem ACE2 transfiziert. Nach 24 Stunden wurden die Proben kombiniert und mit der entsprechenden Verbindung in der angegebenen Konzentration behandelt oder 72 Stunden lang einer Scheinbehandlung unterzogen. Dargestellt sind die Fluoreszenzprozentsätze der mit Schein (DMSO) behandelten Proben. Dargestellt sind der Durchschnitt und die Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Punkte stellen einzelne Experimente dar. Basierend auf einem einseitigen homoskedastischen T-Test wurden statistische Unterschiede zwischen zusammengesetzten und scheinbehandelten Proben berechnet. Bei signifikanten Unterschieden wird der p-Wert angezeigt

Analyse getroffener Verbindungen in Gegenwart von TMPRSS2. A–F Die Fähigkeit der ausgewählten Verbindungen, die Synzytienbildung in Gegenwart von TMPRSS2 zu steigern, wurde mit dem BiMuC-Assay getestet. Hek293T-Zellen wurden neben der für die Synzytienbildung erforderlichen viralen und zellulären Maschinerie mit TMPRSS2 transfiziert. Anschließend wurden die Zellen gemischt und 48 Stunden lang mit der entsprechenden Verbindung behandelt. Dargestellt sind die Fluoreszenzprozentsätze der mit Schein (DMSO) behandelten Proben. Dargestellt sind der Durchschnitt und die Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Punkte stellen einzelne Experimente dar. Basierend auf einem einseitigen homoskedastischen T-Test wurden statistische Unterschiede zwischen zusammengesetzten und scheinbehandelten Proben berechnet. Bei signifikanten Unterschieden wird der p-Wert angezeigt

Um anschließend herauszufinden, ob die ausgewählten Verbindungen unter optimalen Wachstumsbedingungen eine Steigerung der Virusfusion bewirken können, testeten wir sie nach 48-stündiger Inkubation in Gegenwart von TMPRSS2. In diesem Fall war die verstärkende Wirkung der Verbindungen wesentlich stärker als ohne die Protease (Abb. 5). Bemerkenswert ist, dass nach Zugabe der Protease eine konzentrationsabhängige Reaktion beobachtet wurde.

Wir haben auch die Toxizität dieser 6 Verbindungen untersucht, indem wir den ATP-Gehalt in den Zellen gemessen haben (Abb. 6). In Hek 293T-Zellen zeigten alle sechs Verbindungen in hohen Konzentrationen eine gewisse Toxizität. Interessanterweise beobachteten wir trotz der Toxizität bei diesen Konzentrationen einen Anstieg der Zell-Zell-Fusion. Der CC50 und die Zell-Zell-Fusionsaktivität bei dieser Konzentration sind in Tabelle 1 dargestellt; In der linken Spalte wird ein Aktivitätsindex hervorgehoben (Prozentsatz der Zell-Zell-Fusion dividiert durch CC50). Zusätzlich wurde die Toxizität von Ethinylestradiol in Gegenwart von TMPRSS2 getestet (Abb. S2). Die Ergebnisse zeigen, dass die Toxizität der Verbindung durch die Anwesenheit der zellulären Protease nicht beeinflusst wurde. Wir analysierten auch die Toxizität dieser Verbindungen in Vero-Zellen, einer Zelllinie, die häufig zur In-vitro-Züchtung von Viren für Impfstoffzwecke eingesetzt wird [15] (Abb. 6). In dieser Zelllinie zeigte Simvastatin (CC50 ~ 6 µM) deutlich mehr Toxizität als die übrigen Verbindungen. Basierend auf diesen Ergebnissen (Wirksamkeit und Toxizität) haben wir beschlossen, uns von nun an auf Ethaverin, Rabeprazol und Ethinylestradiol zu konzentrieren.

Toxizität getroffener Verbindungen. A, B Die Toxizität in Hek 293T- und Vero E6-Zellen (A bzw. B) wurde nach 48-stündiger Inkubation der Verbindungen in der angegebenen Konzentration analysiert. Die Toxizität wurde durch Messung des ATP-Spiegels mithilfe des Cell-Titer-Glo-Assays (Promega) gemäß den Angaben des Herstellers analysiert. Punkte stellen den Durchschnitt von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar. C Die CC10-, CC50- und CC90-Werte wurden mit den in den Feldern A und B gezeigten Daten berechnet

Um die Rolle der ausgewählten Verbindungen (Ethinylestradiol, Ethaverin und Rabeprazol) beim Eindringen umhüllter Viren weiter zu analysieren, richteten wir unsere Aufmerksamkeit auf das Nipah-Virus (NiV). NiV, ein Mitglied der Paramyxoviridae-Familie, benötigt zwei Proteine, um die Fusion der Virus- und Zellmembranen durchzuführen: das Glykoprotein (G), das sich an ein Rezeptorprotein auf der Oberfläche der Rezeptorzelle bindet, und das Fusionsprotein (F), das Dies wiederum wird die Verschmelzung der Zell- und Virusmembranen erzwingen. NiV ist ein BSL4-beschränkter Agent. Um die Wirkung von Ethinylestradiol, Ethaverin und Rabeprazol zu testen, verwendeten wir daher den BiMuC-Assay, der an die Untersuchung des NiV-Eintritts angepasst ist [8]. Unsere Ergebnisse zeigen einmal mehr, dass alle drei dieser Verbindungen die virusvermittelte Membranfusion in milder dosisabhängiger Weise verstärken können (Abb. 7).

Wirkung von Ethinylestradiol, Ethaverin und Rabeprazol auf die Membranfusion des Nipah-Virus. Um die Wirkung von Ethinylestradiol, Ethaverin und Rabeprazol auf die NiV-Membranfusion zu testen, wurden Hek 293T-Zellen mit Plasmiden, die NiV F, G und Jun kodieren, oder mit Fos transfiziert. Ungefähr 24 Stunden später wurden die Zellpools gemischt und die entsprechende Verbindung in den angegebenen Konzentrationen hinzugefügt. Nach 48 Stunden wurde die Fluoreszenz gemessen. Balken zeigen den Durchschnitt und die Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Die Daten werden als Faltung über die scheinbehandelten Proben dargestellt. Fos). Basierend auf einem einseitigen homoskedastischen t-Test (p-Werte sind über dem entsprechenden Balken angegeben, ns nicht signifikant) wurden statistische Unterschiede zwischen zusammengesetzten und scheinbehandelten Proben berechnet. Bei signifikanten Unterschieden wurde der p-Wert angegeben

Unser Test basiert auf der Synzytienbildung, die die Verschmelzung der Virus- und Zellmembranen während einer Infektion möglicherweise nicht genau wiedergibt. Daher beschließen wir an dieser Stelle, die Wirkung der getroffenen Verbindungen auf das Viruswachstum von SARS-CoV-2 zu analysieren [18, 22, 23]. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Rabeprazol und Ethinylestradiol die Virustiter 48 Stunden nach der Infektion bei Konzentrationen unter CC50 erhöhten (Abb. 8A), obwohl keine signifikanten Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Proben festgestellt wurden. Andererseits steigerte oder beschleunigte Ethaverin das Wachstum von SARS-CoV-2 nicht (Abb. 8A).

Wirkung ausgewählter Verbindungen auf SARS-CoV-2 und IAV. Ein SARS-CoV-2 wurde mit einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 0,01 in Vero-E6-Zellen 48 Stunden lang in Abwesenheit oder Gegenwart von Ethaverin, Rabeprazol oder Ethinylestradiol in den angegebenen Konzentrationen gezüchtet. Als nächstes wurden die Überstände gesammelt und mittels Standard-Plaque-Assay in Vero-E6-Zellen titriert. Die Balken zeigen die durchschnittlichen Plaque-bildenden Einheiten (pfu) und die Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Punkte stellen einzelne Experimente dar. Es wurden keine statistischen Unterschiede, basierend auf einem zweiseitigen homoskedastischen T-Test, zwischen behandelten und scheinbehandelten Proben festgestellt. B IAV/WSN/33 mit einer MOI von 0,001 wurde zur Infektion von Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) verwendet. IAV wurde in Abwesenheit oder Gegenwart von Ethaverin, Rabeprazol oder Ethinylestradiol in den angegebenen Konzentrationen 48 Stunden lang inkubiert. Als nächstes wurden die Überstände gesammelt und mit der TCID50-Methode (50 % Tissue Culture Infective Dose) in MDCK-Zellen titriert. Die Balken zeigen die durchschnittlichen Plaque-bildenden Einheiten (pfu) und die Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Punkte stellen einzelne Experimente dar. Basierend auf einem zweiseitigen homoskedastischen T-Test wurden keine statistischen Unterschiede zwischen behandelten und scheinbehandelten Proben festgestellt

Als nächstes analysierten wir, ob die Fähigkeit dieser Verbindungen, das Viruswachstum zu steigern, auf SARS-CoV-2 beschränkt war. Dazu haben wir die Wirkung von Ethaverin, Rabeprazol und Ethinylestradiol auf das Wachstum des Influenza-A-Virus (IAV) getestet. IAV verursacht jährlich eine erhebliche Morbidität und Mortalität mit saisonalen Epidemieausbrüchen. Saisonale Influenza-Epidemien können durch Impfungen bekämpft werden, und multivalente Impfstoffe, die IAV- und Influenza-B-Virus-Komponenten enthalten, werden jährlich in großem Umfang verteilt. Wie SARS-CoV-2 ist IAV ein umhülltes Virus, das für die Fusion der viralen und zellulären Membranen auf ein Fusionsprotein der Klasse I, das Hämagglutinin (HA)-Protein, angewiesen ist.

IAV-Infektionen führten wir in Madin-Darby-Hundenierenzellen (MDCK) in Gegenwart und Abwesenheit der ausgewählten Verbindungen durch [24]. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass Ethinylestradiol die IAV-Titer um etwa ein Log erhöht (Abb. 8B), obwohl keine signifikanten Unterschiede festgestellt wurden. Andererseits erhöhten Ethaverin und Rabeprazol die Virustiter nicht (Abb. 8B).

Die meisten der in der in unserem Screening verwendeten chemischen Bibliothek enthaltenen Verbindungen sind zugelassene Arzneimittel und werden derzeit in verschiedenen Behandlungen eingesetzt. Es ist jedoch wichtig anzumerken, dass unsere Experimente nicht ausreichen, um zu behaupten, dass die betroffenen Verbindungen, einschließlich Ethinylestradiol, das Ergebnis eines Patienten während einer Infektion mit einem umhüllten Virus verschlechtern könnten.

Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass Ethinylestradiol in vitro verwendet werden könnte, um das Wachstum umhüllter Viren zu steigern. Basierend auf früheren Arbeiten [25,26,27,28,29] könnte Ethinylestradiol die Eigenschaften der viralen und zellulären Membranen verändern, um die Membranfusion und/oder die virale Endozytose zu erleichtern. Verbindungen wie Polybren werden verwendet, um Retrovirus-Infektionen zu verbessern, indem sie die Adhäsion von Virionen an der Zelloberfläche erleichtern, da die Zugabe positiv geladener Polykationen die Abstoßungskräfte zwischen der Zelle und dem Virus verringert und so die Transduktionseffizienz verbessert [30]. Allerdings wurden unseres Wissens bisher keine Verbindungen identifiziert, die die Membranfusion verbessern und anschließend das Viruswachstum steigern und beschleunigen.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass BiMuC zur Überwachung des SARS-CoV-2-Membranfusionsprozesses eingesetzt werden kann. Darüber hinaus zeigen wir, dass diese Methode für die Hochdurchsatz-Identifizierung kleiner Moleküle geeignet ist, die den Viruseintritt einiger umhüllter Viren und damit das Viruswachstum beeinflussen.

Alle Studiendaten sind im Artikel und/oder in den Zusatzinformationen enthalten.

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Wir danken P. Selvi für die hervorragende technische Unterstützung.

Diese Arbeit wurde von der Generalitat Valenciana (PROMETEO/2019/065) und dem Zuschuss PID2020-119111GB-I00 von MCIN/AEI/10.13039/501100011033 unterstützt. OZ wird durch den Zuschuss PID2020-114546RB von MCIN/AEI/10.13039/501100011033 finanziert. LG ist Empfänger eines Doktorandenvertrags (CIACIF/2021/119) der Generatitat Valenciana. MR-S ist Empfänger eines Doktorandenvertrags vom spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation (PRE2021-101042 von MCIN/AEI/10.13039/501100011033). Diese Veröffentlichung wurde auch vom Projekt European Virus Archive GLOBAL (EVA-GLOBAL) unterstützt, das im Rahmen der Fördervereinbarung 871029 Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union erhalten hat.

Abteilung für Biochemie und Molekularbiologie, Universitätsinstitut für Biotechnologie und Biomedizin (BIOTECMED), Universität Valencia, Burjassot, E-46100, Spanien

Mª Jesús García-Murria, Laura Gadea-Salom, Marina Rius-Salvador, Ismael Mingarro und Luis Martínez-Gil

Forschungszentrum für Tiergesundheit, CISA (Nationales Institut für Agrar- und Lebensmittelforschung und -technologie/Consejo Superior de Investigaciones Científicas (INIA/CSIC)), Madrid, Spanien

Sandra Moreno & Alejandro Brun

Referenzlabor für Mykologie, Nationales Zentrum für Mikrobiologie, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, Spanien

Oscar Saragossa

Zentrum für biomedizinische Forschung im Netzwerk für Infektionskrankheiten (CIBERINFEC, Gesundheitsinstitut Carlos III, CB21/13/00105), Madrid, Spanien

Oscar Saragossa

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Von MJGM, OZ, AB, IM und LMG konzipierte Forschung; MJGM, LGS, SM, MRS und LMG führten Untersuchungen durch; MJGM, AB, IM und LMG analysierten Daten; LMG hat den Artikel geschrieben.

Korrespondenz mit Luis Martínez-Gil.

Die Universität Valencia hat einen Patentantrag bezüglich der Verwendung von Ethinylestradiol zur Steigerung des Viruswachstums eingereicht.

Unzutreffend.

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. SARS-CoV-2 S-Protein-induzierte Synzytien. Hek 293T-Zellen wurden mit SARS-CoV-2 S-Protein und menschlichen ACE2-kodierenden Plasmiden (AC) transfiziert oder scheintransfiziert (D). Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit einem Motic AE200-Mikroskop mit einem 10-fach-Objektiv sichtbar gemacht

Ethinylestradiol-Toxizität in Gegenwart von TMPRS2. A und B. Um die Wirkung von TMPRSS2 auf die Ethinylestradiol-Toxizität zu analysieren, wurden Hek 293T-Zellen mit TMPRR22 oder eYFP transfiziert und 48 Stunden später wurde die Toxizität getestet. Die Toxizität wurde durch Messung des ATP-Spiegels mithilfe des Cell-Titer-Glo-Assays (Promega) gemäß den Angaben des Herstellers analysiert. Punkte stellen den Durchschnitt zweier unabhängiger Experimente dar. Die Werte CC10, CC50 und CC90 werden angezeigt

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Nachdrucke und Genehmigungen

García-Murria, MJ, Gadea-Salom, L., Moreno, S. et al. Identifizierung kleiner Moleküle, die die virale Membranfusion verbessern können. Virol J 20, 99 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02068-1

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Eingegangen: 07. Februar 2023

Angenommen: 09. Mai 2023

Veröffentlicht: 24. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02068-1

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